Отслеживание локального поискового поведения, вызванного сахаром, у дрозофилы
Summary
Этот протокол описывает поведенческий тест для регистрации поискового поведения, вызванного сахаром, с использованием Drosophila melanogaster. Этот анализ может быть использован для изучения поведения, связанного с кормлением и поиском пищи, а также лежащих в основе нейронных механизмов.
Abstract
Собирательство имеет важное значение для выживания организмов, поскольку оно позволяет им находить и добывать необходимые пищевые ресурсы. У дрозофилы голод вызывает отчетливое поисковое поведение после употребления небольшого количества сахарного раствора. В этом отчете представлена простая экспериментальная установка для изучения поискового поведения, вызванного сахаром, с целью раскрытия лежащих в его основе механизмов. Ничтожные количества концентрированного раствора сахара вызывают у мух устойчивое поисковое поведение. Было установлено участие интеграции путей в этом поведении, поскольку мухи используют свою траекторию, чтобы вернуться к местоположению сахара. Самые последние данные свидетельствуют о временной модуляции в инициации и интенсивности поискового поведения после приема сахара. Мы также использовали эту установку для искусственной активации специфических рецепторных нейронов глотки, которые вызывают поисковое поведение. Нейрогенетический инструментарий дрозофилы предлагает широкий спектр инструментов и методов, которые могут быть объединены с парадигмой поискового поведения, вызванного сахаром, для изучения нейронных и генетических механизмов, лежащих в основе добывания пищи. Понимание нейронной основы поискового поведения, вызванного голодом, у мух вносит вклад в область нейробиологии в целом, предлагая понимание регуляторных механизмов, которые управляют пищевым поведением не только у других организмов, но и у людей.
Introduction
Поиск пищи и поиск пищи является фундаментальной стратегией выживания, демонстрируемой организмами разных таксонов. У насекомых были идентифицированы два типа пищевого поведения: поиск пищи, вызванный голодом, и локальныйпоиск после еды. Когда насекомые голодны, они полагаются на сенсорные сигналы, чтобы найти источники пищи. Обнаружив и съев небольшой участок пищи, они начинают локальный поиск, характеризующийся извилистыми путями и кружением вокруг места добычи пищи.
Поисковое поведение, вызванное сахаром, особая форма локального поиска, было впервые изучено более 60 лет назад американским биологом Винсентом Детье намухах. Когда мухи голодают, им дают небольшое количество сахара, чтобы он не насыщал их, они начинают локальный поиск. Типичное поисковое поведение характеризуется очень извилистой ходьбой с низкой локомоторикой и высокой частотой поворотов, а также возвращением к месту падения сахара. Последующие исследования изучали это поведение у домашних мух и плодовых мушек 3,4. Начало, интенсивность и продолжительность поиска регулируются внутренним состоянием животного (например, депривацией и мотивацией), а также внешними факторами, такими как доступность и качество ресурсов 1,5,6.
Достижения в технологиях отслеживания предоставили исследователям ценные инструменты для фиксации и анализа поведения на контролируемых аренах. Здесь мы представляем поведенческую парадигму для отслеживания свободно гуляющих мух после употребления сахара. Эта простая установка позволяет изучать поисковое поведение дрозофилы , вызванное сахаром, захватывая и анализируя движение мухи в ответ на концентрированный раствор сахара, подаваемый на арену. Используя передовые технологии отслеживания и методы анализа данных, были успешно количественно определены локомоторные паттерны, пространственное исследование и динамика реакции на сахарные стимулы.
С помощью этого анализа было экспериментально продемонстрировано, что поиск, вызванный сахаром, включает в себя использование интеграции путей и может быть пространственно-временно отделен от потребления сахара 7,8. Кроме того, было показано, что такое поведение может быть вызвано активацией глоточных вкусовых нейронов9. Недавние результаты показывают, что сахарный стимул является не врожденным механизмом высвобождения, а также модуляторным, и контролирует инициацию поведения вовремени. Используя эту парадигму, мы также изучили это поведение у медоносных пчел (Apis mellifera)7,8.
Конечная цель этого исследования состоит в том, чтобы разгадать нейронные цепи и новые генетические компоненты, участвующие в регуляции поискового поведения с помощью целенаправленных генетических манипуляций и методов нейровизуализации. Поведение при поиске пищи оказалось высокоэффективной экспериментальной парадигмой для изучения навигации и пространственной памяти насекомых. Такое поведение дает уникальную возможность исследовать сенсорное восприятие, процессы принятия решений и координацию движений, участвующих в поиске полезных источников пищи у мух. Кроме того, результаты этих исследований имеют более широкое значение для понимания пищевого поведения других организмов, включая человека, поскольку многие фундаментальные генетические и нейронные механизмы эволюционно сохраняются. Нарушение регуляции пищевого поведения связано с различными неврологическими и метаболическими нарушениями10. Таким образом, нейронные и генетические механизмы, лежащие в основе поискового поведения у мух, могут предложить новые пути для понимания и потенциального решения этих сложных проблем со здоровьем человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
Настоящее исследование представляет прямолинейную парадигму для изучения поискового поведения, вызванного сахаром, у дрозофилы, впервые описанной Dethier2. Это врождённое поведение позволяет мухам участвовать в локальном поиске дополнительных пищевых ресурсов после встречи с пищевым вознаграждением. Наиболее важным аспектом экспериментального протокола является надлежащая мотивация мух. Во-первых, мухи должны находиться в состоянии голода, будучи лишенными пищи, но при этом имея доступ к воде, чтобы обеспечить проглатывание сахара. Для того, чтобы получить равномерное состояние голода во всех экспериментальных испытаниях, продолжительность, при которой выживает 90% населения, использовалась в качестве периода голодания. Важно отметить, что индукция поисковой реакции после кормления требует предоставления пищевого стимула достаточного качества, но недостаточно для полного насыщения мух. Таким образом, стандартизация концентрации и количества сахара, а также продолжительности голодания может занять много времени, но является обязательным условием для здорового и надежного поведения.
В этом исследовании 500 мМ, 0,2 мкл раствора сахарозы использовали в качестве стимула для голодающих мух. Потребление сахара вызывает характерное локальное поисковое поведение, характеризующееся повышенным поворотом и частыми возвратами к месту падения сахара (видео 1). И наоборот, голодные мухи, которые не обеспечены сахаром, не проявляют поискового отклика. Примечательно, что все параметры, связанные с поведением, включая длину пути, время пребывания, меандр и количество возвратов, были значительно ниже у некормленных мух. Ранее мы продемонстрировали, что проглатывание воды само по себе не вызывает поискового ответа9.
Эта установка предлагает экономичный и неприхотливый подход к изучению этого врожденного поведения. Несмотря на то, что в этом исследовании используется арена с подсветкой, верхнее освещение также может быть использовано при условии достаточного контраста между мухой и фоном. Используемое программное обеспечение для слежения основано на обнаружении движения мух на статическом фоне13. Настройки камеры и разрешения могут быть отрегулированы в зависимости от конкретного масштаба исследуемого поведения. Важно отметить, что эта методология позволяет изучать различные компоненты поведения при поиске пищи, включая сенсорные сигналы во время поиска пищи, вовлечение и кормление, локомоторный контроль поиска и процессы принятия решений, связанные с эксплуатацией и разведкой, среди прочего. Более того, эта парадигма облегчает исследование локального поиска, поведения, которое обычно наблюдается у различных таксонов в различных экологическихконтекстах. Изучение этого поведения у дрозофилы открывает возможности для научных исследований, направленных на понимание нейронных путей, участвующих в добывании пищи. Мы изучили локальный поиск у медоносных пчел и показали, что поведение имеет сходство с мухами 7,8.
Недавние исследования показали, что локальное поисковое поведение может быть вызвано оптогенетической активацией различных сенсорных нейронов сахара у мух 14,15,16. Тем не менее, остается неясным, в какой степени локальные поиски, наблюдаемые в этих исследованиях, точно отражают естественное поведение мух в ответ на фактическое потребление сахара. Пищевое поведение у мух жестко регулируется, и эти данные указывают на то, что активация глоточных рецепторов сахара инициирует поисковое поведение. Сенсилла вкуса предплюсны отвечает за обнаружение сахара и индуцирование рефлекса разгибания хоботка, в то время как пищевые рецепторы глотки определяют, следует ли продолжать кормление17,18. После попадания в организм раствор сахара проходит через пищевод в преджелудок и попадает в растение, при этом его расширение контролируется возвратным нервом19. Кроме того, стоит отметить, что некоторые из вышеупомянутых исследований включали в себя запряжение или удержание мух, в то время как этот метод позволяет животным свободно ходить на протяжении всего эксперимента. Мухи в наших экспериментах были достаточно мотивированы, чтобы оставаться и искать в пределах арены, не накрывая их крышкой.
Понимание сложного взаимодействия между нервными путями, генетическими факторами и сигналами окружающей среды, которые управляют поисковым поведением мух, может пролить свет на фундаментальные принципы обработки информации, обучения и формирования памяти. Кроме того, дисрегуляция пищевого поведения связана с различными расстройствами человека, включая расстройства пищевого поведения и ожирение. Обширный набор нейрогенетических инструментов, доступных у дрозофилы, предоставляет ценный ресурс для изучения поискового поведения, вызванного сахаром, и разгадки нейронных и генетических механизмов, лежащих в основе поиска пищи. В сочетании с оптогенетическими манипуляциями и функциональной визуализацией эта парадигма представляет собой мощный и многообещающий подход 20,21,22. Тем не менее, изменение настройки для манипулирования нейронной активностью в реальном времени с помощью оптогенетики может быть сложной задачей. Для наблюдения за нейронной активностью в мозге, когда муха выполняет поисковое поведение, потребуется другая установка, например, привязанная муха на мяче. Многие аспекты пищевого поведения, такие как регулирование кормления и процессы принятия решений, хорошо сохраняются у разных видов. Таким образом, информация, полученная при изучении нейронных механизмов поиска пищи у мух, может дать ценную информацию об аналогичных процессах у других организмов, включая человека.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Благодарим Равикумара Бояпати за помощь в обустройстве арены. Эта работа финансируется грантом Wellcome trust DBT Intermediate India Alliance (номер гранта IA/I/15/2/502074) для P.K. M.S. была профинансирована стипендией Индийского совета медицинских исследований (ICMR). Проект A.B. финансировался из институциональных фондов NCBS-TIFR (No 12P4167) и Департамента атомной энергии правительства Индии (No 12-R& D-TFR-5.04-0800 и 12-R& Д-ТКР-5.04-0900).
Materials
| 2 mL Eppendorf tube | Sigma Aldrich | BR780546 | Used to introduce the fly to the sugar drop |
| Agar | SRL | 9002-18-0 | |
| Azure lens | https://www.rmaelectronics.com/azure-photonics-azure-1214mm/ | ||
| Camera | Logicool, Japan | ||
| Corn flour | locally available | ||
| Ctrax software | https://ctrax.sourceforge.net/ | ||
| D-glucose | SRL | 50-99-7 | |
| Flea3 | Sony | https://www.flir.com/products/flea3-usb3/?vertical=machine+vision&segment=iis | |
| glass tube | Borosil | Used to house the flies individually | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34155 | Used to provide access to water for flies during food starvation |
| LED light panel | custom-made in the workshop | ||
| Light Meter | TENMARS | TM-203 | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Fisher Scientific | 99-76-3 | |
| Orthophosphotic acid | SRL | 7664-38-2 | |
| Petri dish (90 mm) | Tarsons | 460090 | |
| Propionic acid | SRL | 79-09-4 | |
| Sucrose | Qualigens | Q28105 | |
| Sugar | locally available | ||
| VirtualDub | https://www.virtualdub.org/ | ||
| White polyvinyl chloride pipe (67 mm inner diameter × 100 mm height) | custom-made in the workshop | ||
| Yeast powder | SRL | REF-34266 |
References
- Jander, R. Ecological aspects of spatial orientation. Annu Rev Ecol Evol Syst. 6 (1), 171-188 (1975).
- Dethier, V. G. Communication by insects: Physiology of dancing. Science. 125 (3243), 331-336 (1957).
- White, J., Tobin, T. R., Bell, W. J. Local search in the housefly Musca domestica after feeding on sucrose. J. Insect Physiol. 30 (6), 477-487 (1984).
- Bell, W. J., Cathy, T., Roggero, R. J., Kipp, L. R., Tobin, T. R. Sucrose stimulated searching behaviour of Drosophila melanogaster in a uniform habitat: modulation by period of deprivation. Animal Behav. 33, 436-448 (1985).
- Dethier, V. G. Microscopic Brains. Science. 143 (3611), 1138-1145 (1964).
- Bell, W. J. Searching behavior patterns in insects. Annu Rev Entomol. 35 (1), 447-467 (1990).
- Brockmann, A., et al. Sugar intake elicits intelligent searching behavior in flies and honey bees. Front Behav Neurosci. 12, 280 (2018).
- Shakeel, M., Brockmann, A. Temporal effects of sugar intake on fly local search and honey bee dance behaviour. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. , (2023).
- Murata, S., Brockmann, A., Tanimura, T. Pharyngeal stimulation with sugar triggers local searching behavior in Drosophila. J Exp Biol. 220 (Pt 8), 3231-3237 (2017).
- Nishijo, H., Ono, T. Neural mechanisms of feeding behavior and its disorders new insights into metabolic syndrome. IntechOpen. , (2021).
- Carvalho, G. B., Kapahi, P., Anderson, D. J., Benzer, S. Allocrine modulation of feeding behavior by the sex peptide of Drosophila. Curr Biol. 16 (7), 692-696 (2006).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Corfas, R. A., Sharma, T., Dickinson, M. H. Diverse food-sensing neurons trigger idiothetic local search in Drosophila. Curr Biol. 29 (10), 1660-1668.e4 (2019).
- Behbahani, A. H., Palmer, E. H., Corfas, R. A., Dickinson, M. H. Drosophila re-zero their path integrator at the center of a fictive food patch. Curr Biol. 31 (20), 4534-4546.e5 (2021).
- Titova, A. V., et al. Displacement experiments provide evidence for path integration in Drosophila. J Exp Biol. 226 (12), jeb245289 (2023).
- Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a review. Cell Tissue Res. 275 (1), 3-26 (1994).
- LeDue, E. E., Chen, Y. C., Jung, A. Y., Dahanukar, A., Gordon, M. D. Pharyngeal sense organs drive robust sugar consumption in Drosophila. Nat Commun. 6, 6667 (2015).
- Gelperin, A. Abdominal sensory neurons providing negative feedback to the feeding behavior of the blowfly. Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 72 (1), 17-31 (1971).
- Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).
- DeAngelis, B. D., Zavatone-Veth, J. A., Gonzalez-Suarez, A. D., Clark, D. A. Spatiotemporally precise optogenetic activation of sensory neurons in freely walking Drosophila. Elife. 9, e54183 (2020).
- Grover, D., Katsuki, T., Li, J., Dawkins, T. J., Greenspan, R. J. Imaging brain activity during complex social behaviors in Drosophila with Flyception2. Nat Commun. 11 (1), 623 (2020).
