В этом исследовании представлен автоматизированный метод генерации 3-мерных органоидов глиобластомы, полученных от пациентов, с использованием измельчителя тканей. Метод обеспечивает подходящий и эффективный подход к получению таких органоидов для терапевтического тестирования.
Глиобластома ИДГ-дикого типа, ЦНС 4 степени тяжести (ГБМ) является первичной опухолью головного мозга, связанной с низкой выживаемостью пациентов, несмотря на агрессивное лечение. Разработка реалистичных моделей ex vivo остается сложной задачей. Модели 3-мерных органоидов (PDO), полученные от пациентов, предлагают инновационные платформы, которые фиксируют фенотипическую и молекулярную гетерогенность GBM, сохраняя при этом ключевые характеристики исходных опухолей. Тем не менее, ручное препарирование для создания PDO отнимает много времени, стоит дорого и может привести к появлению ряда PDO неправильной формы и неравномерного размера. В данном исследовании представлен инновационный метод производства PDO с использованием автоматизированного измельчителя тканей. Образцы опухолей у четырех пациентов с ГБМ и одной астроцитомой, IDH-мутантной, ЦНС 2 степени 2-й степени ВОЗ обрабатывали вручную, а также с помощью измельчителя тканей. При ручном подходе опухолевый материал рассекался с помощью скальпеля под микроскопическим контролем, в то время как измельчитель тканей использовался под тремя разными углами. После культивирования на орбитальном шейкере при 37 °C морфологические изменения оценивали с помощью яркопольной микроскопии, а пролиферацию (Ki67) и апоптоз (CC3) оценивали с помощью иммунофлуоресценции через 6 недель. Метод измельчения тканей сократил почти 70% времени производства и привел к значительно более высокому среднему количеству PDO по сравнению с обработанной вручную тканью, начиная со второй недели (неделя 2: 801 против 601, P = 0,018; неделя 3: 1105 против 771, P = 0,032; и неделя 4:1195 против 784, P < 0,01). Оценка качества показала схожие показатели апоптоза и пролиферации опухолевых клеток для обоих методов производства. Таким образом, метод автоматизированного измельчителя тканей предлагает более эффективный подход с точки зрения времени и выхода PDO. Этот метод является перспективным для медикаментозного или иммунотерапевтического скрининга пациентов с ГБМ.
Низкодифференцированные глиомы (LGG) представляют собой группу относительно редких опухолей головного мозга, которые, как правило, проявляются как медленно растущие и менее агрессивные по сравнению с глиомами высокой степени злокачественности, такими как глиобластома. Они могут возникать как у взрослых, так и у детей, с несколько большей распространенностью у взрослых. Точная распространенность варьируется в зависимости от региона и популяции, но на долю LGG приходится примерно 15–20% всех первичных опухолей головного мозга1. Стратегии лечения LGG часто включают комбинацию хирургического вмешательства, лучевой терапии и химиотерапии, направленные на максимизацию резекции опухоли при сохранении неврологической функции. Лечение ЛГГ может быть сложным, и выбор терапии может зависеть от таких факторов, как локализация опухоли и молекулярные характеристики2. Прогресс в понимании генетических и молекулярных основ LGG привел к более целенаправленной терапии, и текущие исследования продолжают совершенствовать подходы к лечению.
С другой стороны, глиобластома, ИДГ-дикий тип, ЦНС 4-й степени (ГБМ) является наиболее распространенной первичной опухолью головного мозга, встречающейся у взрослых, с частотой заболеваемости 3,19-4,17 случая на 100 000 человеко-лет. GBM вызывает такие симптомы, как головные боли, судороги, очаговый неврологический дефицит, изменения личности и повышение внутричерепного давления. Стандартное лечение ГБМ включает уменьшение объема опухоли, если это возможно, с последующей лучевой терапией в сочетании с темозоломидом4. Кроме того, комбинация темозоломида и ломустина может повысить медиану общей выживаемости у пациентов с метилированием промотора O 6-метилгуанин-метилтрансферазы (MGMT)5. Однако, несмотря на эти недавние терапевтические подходы, ГБМ остается неизлечимым заболеванием с плохим прогнозом, характеризующимся средней общей выживаемостью пациентов от 16 до 20,9 месяцев при добавлении полей для лечения опухолей (TTFields) 3,6. Несколько иммунотерапевтических подходов были исследованы в GBM, но продемонстрировали ограниченную эффективность in vivo. Кроме того, клинические и доклинические ограничения препятствуют терапевтическим прорывам7. Создание подходящей и реалистичной модели ex vivo было сложной задачей из-за интер-8 и внутриопухолевой гетерогенности 9 GBM.
Обычные 2-мерные (2D) клеточные линии пациента представляют собой однородные клеточные популяции и подходят для высокопроизводительного скрининга лекарственных препаратов. Тем не менее, полученные от пациентов и иммортализированные клеточные линии не могут адекватно имитировать GBM из-за различий в условиях роста и отклонений в генотипических и фенотипических признаках после многократных пассажей 10,11,12.
С другой стороны, в последнее время в качестве перспективных систем появились 3D-модели органоидов, воспроизводящие фенотипическую и молекулярную гетерогенность органов и различных типов рака 13,14,15,16,17,18. В контексте ГБМ церебральные органоиды были генетически модифицированы для имитации опухолеподобных характеристик16,17 или культивированы совместно с ГСК или сфероидами для индуцирования инфильтрации опухолевых клеток18,19. В то время как полученные от пациентов органоиды GBM, культивируемые с помощью Matrigel и EGF/bFGF, демонстрируют такие признаки GBM, как гетерогенность стволовых клеток и гипоксия20, остается неясным, в какой степени эта модель может представлять ключевые молекулярные свойства новообразований пациентов.
Органоиды GBM, полученные от пациентов (PDO), являются многообещающими моделями, которые могут сохранять преобладающие черты своих аналогичных родительских опухолей, включая гистологические характеристики, клеточное разнообразие, экспрессию генов и мутационные профили. Кроме того, они быстро внедряются при имплантации в мозг взрослых грызунов, обеспечивая реалистичную модель для тестирования лекарств иперсонализированной терапии. Тем не менее, ручное препарирование опухолевой ткани для создания PDO является трудоемким и дорогостоящим процессом. Таким образом, существует острая потребность в быстром методе, который может производить большое количество ЗОП, что позволяет проводить всестороннюю оценку различных терапевтических подходов, перспективных для индивидуализированного тестирования лекарственных средств. В этом исследовании описывается новый метод изготовления ЗОП непосредственно из свежерассеченной опухолевой ткани с использованием автоматического измельчителя тканей. Кроме того, PDO, полученные с помощью этого метода, сравнивали с препарированными вручную PDO у тех же пациентов с точки зрения количества PDO, морфологических особенностей, апоптоза и пролиферации опухолевых клеток.
В этом исследовании представлен быстрый и эффективный метод создания PDO. GBM остается сложной для лечения опухолью, часто характеризующейся рецидивом и высоким бременем заболевания 3,6. Срочно необходимы инновационные терапевтические подходы, поскольку многообещающие результаты, наблюдаемые in vitro, часто не демонстрируют эффективность in vivo во время испытаний I фазы. Одной из причин этого расхождения может быть ограниченная способность иммортализированных клеточных линий, выращенных в монослойных культурах, отражать сложные межклеточные взаимодействия и генетические свойства родительской опухоли. Учитывая высокую меж- и внутриопухолевую гетерогенность GBM 8,9, персонализированная таргетная терапия является предпочтительной и может иметь перспективы для будущего применения. В отличие от 2D-адгезивных клеточных линий, органоиды обладают способностью сохранять свойства родительскойткани, однако сложные межклеточные взаимодействия между опухолью и нормальным мозгом имеют первостепенное значение и потенциально могут быть упущены из виду этой моделью. Тем не менее, ручная генерация PDO является трудоемким процессом, а повреждение тканей, вызванное сдавливанием скальпелем во время резки, может препятствовать успешному росту PDO. Поэтому был оптимизирован автоматизированный метод с использованием измельчителя тканей для создания большего количества PDO с меньшими затратами времени и усилий. Кроме того, мы продемонстрировали, что общая скорость пролиферации и апоптоза не различалась между двумя подходами.
Подход C прост, прост в реализации и позволяет генерировать большее количество PDO (рис. 3). Ротация ткани между вторым и третьим раундами измельчения была определена как критический шаг в протоколе. На этом этапе ткань уже потеряла целостность и может легко развалиться, в результате чего получаются более крупные куски, требующие дополнительного разрезания или ручного препарирования под микроскопом. В то время как автоматизированный подход с помощью измельчителя позволяет задавать размер резки с большей точностью, при ручном подходе отсутствует точность определения размера PDO, что приводит к неравномерной форме и размеру PDO, что является недостатком для сравнительного скрининга лекарственных средств (Рисунок 2). Тем не менее, с помощью предлагаемого метода стандартизация количества клеток для каждого PDO не достигается, что потенциально может стать недостатком для стандартизированных протоколов скрининга лекарственных средств. Преимущества и недостатки различных методов генерации органоидов 18,19,20,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,
37,38,39,40,41,42 и их применение сведены в таблицу 3.
Ткань GBM может варьироваться по консистенции, от жесткой (зона инфильтрации) до мягкой (некротическое ядро), что может создать проблемы для автоматизированного подхода с помощью измельчителя. Если ткань слишком жесткая, измельчитель может сдавить и повредить ее, в то время как слишком мягкие ткани могут быть раздавлены. Выбранная ткань демонстрировала отличительные признаки, в том числе промежуточный уровень упругости, спорадически отличаясь розовато-сероватой окраской, а не коричневым или желтым обесцвечиванием. Ткань, обладающая губчатой и легко рассыпающейся текстурой, продемонстрировала превосходную сохранность в агарозных блоках, в то время как чрезвычайно нежная и разжиженная опухолевая ткань была исключена из процедуры забора. Тем не менее, метод измельчения позволил успешно создать большее количество PDO по сравнению с ручным подходом, даже при неоптимальной консистенции ткани. Ключевым решением является поддержание тесного взаимодействия с хирургом, выполняющим резекцию опухоли, для обработки тканей из разных областей опухоли. В случаях неоптимальной консистенции ткани полезно было вручную доработать ткань под микроскопом после измельчения. Чтобы учесть гетерогенность, опухолевую ткань первоначально разделили на шесть сегментов, каждый из которых впоследствии был разделен пополам для подхода С или М. В пределах этих шести отдельных разделов ожидается существенная степень гетерогенности. Более того, даже в пределах ЗОП из одного и того же участка или скважины наличие различных субпопуляций вполне вероятно.
В качестве доказательства концепции, данные о пролиферации и апоптозе были получены от двух пациентов с GBM и одного пациента с LGG, которые не показывают существенных различий между двумя методами. Генерация PDO не ограничивается высокозлокачественными опухолями головного мозга, но также может применяться к LGG. В этом исследовании подчеркивается, что LGG редко демонстрируют рост в 2D-культуре, что делает разработку точной модели для их исследования очень ценной. Этот протокол призван продемонстрировать универсальность этого подхода в быстром и эффективном генерировании PDO из GBM, а также LGG.
В целом, PDO могут быть использованы в будущем для ориентированного на пациента дотерапевтического тестирования таргетной терапии при злокачественных опухолях головного мозга. Предоставление быстрого и эффективного метода индивидуального скрининга лекарственных препаратов имеет решающее значение, поскольку прогрессирование опухоли происходит быстро, и отчаянно необходимы варианты лечения. В качестве следующего шага модель PDO может быть оценена с помощью различных иммунотерапевтических подходов, чтобы лучше имитировать реальные ответы на лечение. В будущем PDO могут быть использованы для получения сложных выводов о необходимости дальнейшего изучения и оценки методов лечения в клинических условиях.
The authors have nothing to disclose.
Исследование финансировалось Междисциплинарным центром клинических исследований (IZKF, B-450) в Вюрцбурге, Баварским центром исследования рака (BZKF) и изданием при поддержке Издательского фонда открытого доступа Вюрцбургского университета. Благодарим за техническую поддержку Дагмар Хеммерих и Зиглинду Кюнель, отделение экспериментальной нейрохирургии отделения нейрохирургии Университетской клиники Вюрцбурга. Рисунок 1 был создан с помощью www.biorender.com.
2-mercaptoethanol (1000x) | Gibco | 21985023 | |
30% formaldehyde methanol-free | Carl Roth | 4235.1 | Used in 4% concentration |
70% ethanol solution | For sterilisation | ||
Agarose tablets 0.5 g | Carl Roth | HP67.7 | |
Amphotericin B 250 µg/mL | Gibco | 15290018 | |
Anatomical forceps | Hartstein | N/A | |
Anatomical spatula | Hartstein | N/A | |
B-27 Supplement without vitamin A (50x) | Gibco | 12587010 | |
Biopsy cassette with cover | Resolab | 37001-b | |
Blades for McIlwain Tissue Chopper | Campden instruments | Model TC752-1 | |
CC3 antibody (Asp 175) | Cells signaling technology | 9661 | |
Disposable scalpel | Feather | 0200130015 | |
Distilled water | Gibco | 15230089 | To dilute the formaldehyd |
Dulbecco's Modified Eagle Serum Nutrient Mixture (DMEM) F-12 (1:1) (1x) | Gibco | 11330032 | Includes L-Glutamine and 15 mM HEPES |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Sciences | D8537-500ML | Modified, without calcium, chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 433357 | |
Falcon tube 50 ml Cellstar | Greiner Bio-One | 227261 | |
GFAP antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc33673 | |
Glass beaker | N/A | N/A | |
Glass petri dish | N/A | N/A | |
GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050061 | |
Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo scientific | 51032875 | |
Herasafe 2025 Biological Safety Cabinet | Thermo scientific | 5016643 | |
Hibernate-A | Gibco | A1247501 | |
Histoacryl glue | B. Braun surgical | 1050052 | |
Human Insulin, Solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-360248 | |
Ice box | N/A | N/A | |
Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
McIlwain Tissue Chopper | Cavey Laboratory Engineering | 51350V | |
Microscope Leica DMI 3000B, DMI 4000B, DMI 6000B | Leica | DMI6000B | For brightfield and immunofluorescence pictures |
Microscope stereozoom S9D | Leica | W841832 | For manual cutting and to organoids monitoring |
Microwave | Bosch | N/A | To heat the agarose solution |
Mounting plastic discs | Cavey Laboratory Engineering | 51354 | |
N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
NEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) (100x) | Gibco | 11140050 | |
Neurobasal (1x) | Gibco | 21103049 | |
Orbital shaking machine Rotamax120 | Heidolph | 10304491 | |
Penicilin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Plastic petri dishes Cellstar | greiner bio-one | 628160 | n = 12 |
Single channel pipette 1000 µm | Eppendorf | 4924000010 | |
Single channel pipette 5000 µm | Eppendorf | EP3123000276 | |
Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 23.0 | IBM | ||
Surgipath Paraplast | Leica | 39601006 | Embedding medium |
Ultra-low attachment Nucleon Sphera 6-well plate | Thermo Scientific | 174932 |