Este estudo introduz um método automatizado para gerar organoides 3-dimensionais de glioblastoma derivados do paciente utilizando um picador de tecido. O método fornece uma abordagem adequada e eficaz para a obtenção de tais organoides para testes terapêuticos.
O glioblastoma, tipo IDH-selvagem, grau 4 (GBM) da OMS do SNC é um tumor cerebral primário associado à baixa sobrevida do paciente, apesar do tratamento agressivo. O desenvolvimento de modelos ex vivo realistas continua a ser um desafio. Modelos organoides 3-dimensionais derivados de pacientes (DOP) oferecem plataformas inovadoras que capturam a heterogeneidade fenotípica e molecular do GBM, preservando as principais características dos tumores originais. No entanto, a dissecção manual para geração de DOP é demorada, cara e pode resultar em uma série de DOPs irregulares e de tamanho desigual. Este estudo apresenta um método inovador para a produção de DOP utilizando um picador de tecido automatizado. Amostras tumorais de quatro pacientes com GBM e um astrocitoma, mutante IDH, grau 2 da OMS foram processadas manualmente, bem como usando o picador de tecido. Na abordagem manual, o material tumoral foi dissecado com bisturi sob controle microscópico, enquanto o picador de tecido foi empregado em três ângulos diferentes. Após cultura em agitador orbitário a 37 °C, as alterações morfológicas foram avaliadas por microscopia de campo claro, enquanto proliferação (Ki67) e apoptose (CC3) foram avaliadas por imunofluorescência após 6 semanas. O método do picador de tecido reduziu quase 70% do tempo de fabricação e resultou em uma contagem média de DOPs significativamente maior em comparação com o tecido processado manualmente a partir da segunda semana (semana 2: 801 vs. 601, P = 0,018; semana 3: 1105 vs. 771, P = 0,032; e semana 4:1195 vs. 784, P < 0,01). A avaliação da qualidade revelou taxas semelhantes de apoptose e proliferação de células tumorais para ambos os métodos de fabricação. Portanto, o método automatizado de corte de tecido oferece uma abordagem mais eficiente em termos de tempo e rendimento de DOP. Esse método é promissor para a triagem de pacientes com GBM ou imunoterapia.
Os gliomas de baixo grau (LGGs) são um grupo de tumores cerebrais relativamente raros que tipicamente se apresentam como de crescimento lento e menos agressivos em comparação com gliomas de alto grau como o glioblastoma. Podem ocorrer tanto em adultos quanto em crianças, com prevalência um pouco maior em adultos. A prevalência exata varia de acordo com a região e a população, mas os LGGs são responsáveis por aproximadamente 15%-20% de todos os tumores cerebrais primários1. As estratégias de tratamento para LGGs geralmente envolvem uma combinação de cirurgia, radioterapia e quimioterapia, com o objetivo de maximizar a ressecção tumoral enquanto preserva a função neurológica. O manejo dos LGGs pode ser complexo, e a escolha da terapia pode depender de fatores como localização do tumor e característicasmoleculares2. Os avanços na compreensão dos fundamentos genéticos e moleculares dos LGGs levaram a terapias mais direcionadas, e a pesquisa em andamento continua a refinar as abordagens de tratamento.
Já o glioblastoma do tipo IDH-selvagem, grau 4 (GBM) da OMS no SNC é o tumor cerebral primário mais prevalente encontrado em adultos, com taxa de incidência entre 3,19-4,17 casos por 100.000pessoas-ano3. O GBM causa sintomas como dores de cabeça, convulsões, déficits neurológicos focais, alterações na personalidade e aumento da pressão intracraniana. O tratamento padrão para GBM envolve remoção de volume do tumor, se possível, seguido de radioterapia combinada com Temozolomida4. Além disso, a combinação de Temozolomida e Lomustina pode aumentar a taxa de sobrevida global mediana em pacientes com metilação do promotor da O6-metilguanina-metiltransferase (MGMT) 5. No entanto, apesar dessas abordagens terapêuticas recentes, o GBM permanece uma doença incurável e de mau prognóstico, caracterizada por uma taxa de sobrevida global mediana dos pacientes de 16 meses até 20,9 meses quando Campos de Tratamento de Tumor (TTFields) é adicionado 3,6. Várias abordagens imunoterápicas foram investigadas no GBM, mas demonstraram eficácia limitada in vivo. Além disso, limitações clínicas e pré-clínicas dificultam o avanço terapêutico7. O estabelecimento de um modelo ex vivo adequado e realista tem sido um desafio devido à heterogeneidade inter-8 e intratumoral9 do GBM.
Linhagens celulares convencionais de pacientes em 2 dimensões (2D) representam populações celulares homogêneas e são adequadas para triagem de drogas de alto rendimento. No entanto, linhagens celulares derivadas do paciente e imortalizadas não conseguem mimetizar adequadamente o GBM devido a diferenças nas condições de crescimento e desvios nas características genotípicas e fenotípicas após múltiplas passagens 10,11,12.
Por outro lado, modelos organoides 3D têm emergido recentemente como sistemas promissores que replicam a heterogeneidade fenotípica e molecular de órgãos e vários tipos de câncer13,14,15,16,17,18. No contexto do GBM, organoides cerebrais têm sido geneticamente modificados para simular característicastumorais16,17 ou co-cultivados com GSCs ou esferoides para induzir infiltração de células tumorais 18,19. Embora organoides GBM derivados de pacientes cultivados com Matrigel e EGF/bFGF exibam características do GBM, como heterogeneidade e hipóxia de células-tronco20, permanece incerto até que ponto esse modelo pode representar as principais propriedades moleculares das neoplasias dos pacientes.
Os organoides GBM derivados de pacientes (PDOs) são modelos promissores que podem manter as características predominantes de seus tumores parentais análogos, incluindo características histológicas, diversidade celular, expressão gênica e perfis mutacionais. Além disso, são rapidamente infiltrados após a implantação em cérebros de roedores adultos, fornecendo um modelo realista para testes de drogas e terapia personalizada21. No entanto, a dissecção manual do tecido tumoral para gerar DOPs é demorada e dispendiosa. Portanto, existe uma necessidade urgente de um método rápido que possa produzir um grande número de DOPs, permitindo uma avaliação abrangente de diferentes abordagens terapêuticas promissoras para testes individualizados de drogas. Este estudo descreve um novo método para a fabricação de DOPs diretamente a partir de tecido tumoral recém-dissecado usando um picador automático de tecido. Além disso, as DOPs geradas por esse método foram comparadas com as DOPs dissecadas manualmente dos mesmos pacientes em termos de contagem de DOP, características morfológicas, apoptose e proliferação de células tumorais.
Este estudo apresenta um método rápido e eficiente para a geração de DOPs. O GBM continua sendo um tumor desafiador de tratar, muitas vezes caracterizado por recidiva e alta carga dedoença3,6. Abordagens terapêuticas inovadoras são urgentemente necessárias, pois resultados promissores observados in vitro muitas vezes não conseguem demonstrar eficácia in vivo durante os ensaios de fase I. Uma das razões para essa discrepância pode ser a capacidade limitada de linhagens celulares imortalizadas derivadas do paciente, cultivadas em culturas de monocamadas, de refletir as complexas interações célula-célula e as propriedades genéticas do tumor parental. Dada a alta heterogeneidade inter e intratumoral do GBM 8,9, terapias-alvo personalizadas são preferidas e podem ser promissoras para aplicações futuras. Em contraste com as linhagens celulares aderentes 2D, os organoides têm a capacidade de reter as propriedades do tecido parental21, mas interações celulares complexas entre o tumor e o cérebro normal são de suma importância e poderiam ser potencialmente negligenciadas por esse modelo. No entanto, a geração manual de DOPs é um processo demorado, e o dano tecidual causado pela compressão com bisturi durante o corte pode dificultar o crescimento bem-sucedido da DOP. Portanto, um método automatizado foi otimizado usando um picador de tecido para gerar maior número de DOPs com tempo e esforço reduzidos. Além disso, demonstramos que as taxas globais de proliferação e apoptose não diferiram entre as duas abordagens.
A abordagem C é direta, fácil de implementar e permite a geração de um número maior de DOPs (Figura 3). A rotação do tecido entre a segunda e a terceira rodadas de corte foi identificada como etapa crítica do protocolo. Nesta fase, o tecido já perdeu sua integridade e pode facilmente se desfazer, resultando em pedaços maiores que requerem corte adicional ou dissecção manual sob o microscópio. Enquanto a abordagem automatizada do helicóptero permite um tamanho de corte predefinido com maior precisão, a abordagem manual carece de precisão na determinação do tamanho das DOP, levando a DOPs de formato e tamanho desiguais, o que é uma desvantagem para a triagem comparativa de drogas (Figura 2). No entanto, com o método proposto, a padronização do número de células por DOP não é alcançada, potencialmente representando uma desvantagem para protocolos padronizados de triagem de drogas. As vantagens e desvantagens das diferentes técnicas de geração de organoides 18,19,20,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,
37,38,39,40,41,42 e suas aplicações estão resumidas na Tabela 3.
O tecido GBM pode variar em consistência, variando de resistente (zona de infiltração) a mole (núcleo necrótico), o que pode representar desafios para a abordagem automatizada do helicóptero. Se o tecido for muito resistente, o picador pode apertá-lo e danificá-lo, enquanto o tecido muito mole pode ser esmagado. O tecido escolhido apresentou atributos distintivos, incluindo um nível intermediário de firmeza, esporadicamente caracterizando uma coloração róseo-acinzentada em vez de manifestar descoloração marrom ou amarela. Tecidos de textura esponjosa e prontamente esfarelada demonstraram preservação superior dentro dos blocos de agarose, enquanto tecido tumoral extremamente delicado e liquefeito foi omitido do procedimento de amostragem. No entanto, a abordagem do chopper possibilitou a geração bem-sucedida de um número maior de DOPs em comparação com a abordagem manual, mesmo com tecido de consistência subótima. A solução chave é manter uma interação estreita com o cirurgião que realiza a ressecção do tumor para processar o tecido de diferentes áreas do tumor. Em casos de consistência tecidual subótima, o retrabalho manual do tecido ao microscópio foi uma adição útil após o corte. Para explicar a heterogeneidade, o tecido tumoral foi inicialmente dividido em seis segmentos, cada um posteriormente reduzido pela metade para a abordagem C ou M. Dentro dessas seis seções distintas, um grau substancial de heterogeneidade é antecipado. Além disso, mesmo dentro das DOPs da mesma seção ou poço, a presença de subpopulações distintas é plausível.
Como prova de conceito, os dados de proliferação e apoptose foram relatados de dois pacientes com GBM e um paciente com LGG, que não mostram diferenças significativas entre os dois métodos. A geração de DOPs não se limita a tumores cerebrais altamente malignos, mas também pode ser aplicada a LGGs. Este estudo destaca que o LGG raramente exibe crescimento em cultura 2D, tornando o desenvolvimento de um modelo preciso para seu estudo altamente valioso. Este protocolo visa demonstrar a versatilidade desta abordagem na geração de DOPs a partir do GBM, bem como LGG de forma rápida e eficaz.
Em geral, as DOPs poderiam ser utilizadas no futuro para testes pré-terapêuticos orientados ao paciente de terapias-alvo em tumores cerebrais malignos. Fornecer um método rápido e eficiente para triagem individualizada de drogas é crucial, pois a progressão do tumor ocorre rapidamente e opções de tratamento de resgate são desesperadamente necessárias. Como próximo passo, o modelo de DOP poderia ser avaliado com várias abordagens imunoterápicas para melhor mimetizar respostas reais ao tratamento. No futuro, as DOPs poderão ser utilizadas para tirar conclusões sofisticadas sobre a necessidade de maior exploração e avaliação de terapias em um ambiente clínico.
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi financiada pelo Centro Interdisciplinar de Pesquisa Clínica (IZKF, B-450) Würzburg, Bavarian Center of Cancer Research (BZKF) e pela publicação apoiada pelo Open Access Publishing Fund da Universidade de Würzburg. Agradecemos a Dagmar Hemmerich e Siglinde Kühnel, ambas da Seção de Neurocirurgia Experimental do Departamento de Neurocirurgia do Hospital Universitário de Würzburg, pelo suporte técnico. A Figura 1 foi criada usando www.biorender.com.
2-mercaptoethanol (1000x) | Gibco | 21985023 | |
30% formaldehyde methanol-free | Carl Roth | 4235.1 | Used in 4% concentration |
70% ethanol solution | For sterilisation | ||
Agarose tablets 0.5 g | Carl Roth | HP67.7 | |
Amphotericin B 250 µg/mL | Gibco | 15290018 | |
Anatomical forceps | Hartstein | N/A | |
Anatomical spatula | Hartstein | N/A | |
B-27 Supplement without vitamin A (50x) | Gibco | 12587010 | |
Biopsy cassette with cover | Resolab | 37001-b | |
Blades for McIlwain Tissue Chopper | Campden instruments | Model TC752-1 | |
CC3 antibody (Asp 175) | Cells signaling technology | 9661 | |
Disposable scalpel | Feather | 0200130015 | |
Distilled water | Gibco | 15230089 | To dilute the formaldehyd |
Dulbecco's Modified Eagle Serum Nutrient Mixture (DMEM) F-12 (1:1) (1x) | Gibco | 11330032 | Includes L-Glutamine and 15 mM HEPES |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Sciences | D8537-500ML | Modified, without calcium, chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 433357 | |
Falcon tube 50 ml Cellstar | Greiner Bio-One | 227261 | |
GFAP antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc33673 | |
Glass beaker | N/A | N/A | |
Glass petri dish | N/A | N/A | |
GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050061 | |
Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo scientific | 51032875 | |
Herasafe 2025 Biological Safety Cabinet | Thermo scientific | 5016643 | |
Hibernate-A | Gibco | A1247501 | |
Histoacryl glue | B. Braun surgical | 1050052 | |
Human Insulin, Solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-360248 | |
Ice box | N/A | N/A | |
Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
McIlwain Tissue Chopper | Cavey Laboratory Engineering | 51350V | |
Microscope Leica DMI 3000B, DMI 4000B, DMI 6000B | Leica | DMI6000B | For brightfield and immunofluorescence pictures |
Microscope stereozoom S9D | Leica | W841832 | For manual cutting and to organoids monitoring |
Microwave | Bosch | N/A | To heat the agarose solution |
Mounting plastic discs | Cavey Laboratory Engineering | 51354 | |
N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
NEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) (100x) | Gibco | 11140050 | |
Neurobasal (1x) | Gibco | 21103049 | |
Orbital shaking machine Rotamax120 | Heidolph | 10304491 | |
Penicilin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Plastic petri dishes Cellstar | greiner bio-one | 628160 | n = 12 |
Single channel pipette 1000 µm | Eppendorf | 4924000010 | |
Single channel pipette 5000 µm | Eppendorf | EP3123000276 | |
Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 23.0 | IBM | ||
Surgipath Paraplast | Leica | 39601006 | Embedding medium |
Ultra-low attachment Nucleon Sphera 6-well plate | Thermo Scientific | 174932 |