組織チョッパーを用いたex vivo患者由来神経膠腫オルガノイドの培養
Summary
この研究では、組織チョッパーを利用して患者由来の膠芽腫の3次元オルガノイドを自動的に生成する方法を紹介します。この方法は、治療試験のためにそのようなオルガノイドを得るための適切かつ効果的なアプローチを提供する。
Abstract
神経膠芽腫、IDH野生型、CNS WHOグレード4(GBM)は、積極的な治療にもかかわらず患者の生存率が低いことに関連する原発性脳腫瘍です。現実的な ex vivo モデルの開発は依然として困難である。患者由来の3次元オルガノイド(PDO)モデルは、元の腫瘍の主要な特徴を維持しながら、GBMの表現型および分子の不均一性を捉える革新的なプラットフォームを提供します。しかし、PDO生成のための手作業による解剖は、時間と費用がかかり、不規則で不均一なサイズのPDOが多数生成される可能性があります。この研究は、自動組織チョッパーを使用したPDO生産の革新的な方法を提示します。4人のGBM患者と1人の星状細胞腫、IDH変異体、CNS WHOグレード2の患者からの腫瘍サンプルを、組織チョッパーを使用して手動で処理しました。手動アプローチでは、顕微鏡制御下でメスを使用して腫瘍物質を解剖し、組織チョッパーを3つの異なる角度で使用しました。37°Cの軌道振とう機で培養した後、明視野顕微鏡を用いて形態学的変化を評価し、6週間後の増殖(Ki67)およびアポトーシス(CC3)を免疫蛍光法で評価した。組織チョッパー法は、製造時間を約70%短縮し、2週目以降の手作業で処理した組織と比較して、PDOの平均数が有意に増加しました(2週目:801 vs. 601、 P = 0.018、3週目:1105 vs. 771、 P = 0.032、および4:1195 vs. 784、 P < 0.01)。品質評価により、両方の製造方法で腫瘍細胞のアポトーシスと増殖の速度が類似していることが明らかになりました。したがって、自動組織チョッパー法は、時間とPDO収量の点でより効率的なアプローチを提供します。この方法は、膠芽腫患者の薬物療法または免疫療法のスクリーニングに有望です。
Introduction
低悪性度神経膠腫(LGG)は、比較的まれな脳腫瘍のグループであり、通常、神経膠芽腫などの高悪性度神経膠腫と比較して、成長が遅く、攻撃性が低いものとして現れます。それらは大人と子供の両方に発生する可能性があり、成人の有病率はわずかに高くなります。正確な有病率は地域や人口によって異なりますが、LGGはすべての原発性脳腫瘍の約15%〜20%を占めています1。LGGの治療戦略は、手術、放射線療法、化学療法の組み合わせを伴うことが多く、神経機能を維持しながら腫瘍切除を最大化することを目的としています。LGGの管理は複雑になる場合があり、治療法の選択は腫瘍の位置や分子特性などの要因に依存する可能性があります2。LGGの遺伝的および分子的基盤の理解の進歩により、より標的を絞った治療法が開発され、治療アプローチの改良が続けられています。
一方、神経膠芽腫、IDH野生型、CNS WHOグレード4(GBM)は、成人に見られる最も一般的な原発性脳腫瘍であり、発生率は100,000人年あたり3.19〜4.17例です3。膠芽腫は、頭痛、発作、限局性神経障害、人格の変化、頭蓋内圧の上昇などの症状を引き起こします。膠芽腫の標準治療では、可能であれば腫瘍の減量を行い、その後、テモゾロミド4と併用した放射線療法を行う。さらに、テモゾロミドとロムスチンの併用は、O6-メチルグアニン-メチルトランスフェラーゼ(MGMT)-プロモーターメチル化5を有する患者の全生存率中央値を高める可能性がある。しかし、これらの最近の治療アプローチにもかかわらず、膠芽腫は依然として予後不良の不治の病であり、腫瘍治療野(TTフィールド)を追加すると、患者の全生存期間の中央値は16か月から20.9か月です3,6。膠芽腫ではいくつかの免疫療法アプローチが研究されていますが、in vivoでは限られた有効性が実証されています。さらに、臨床的および前臨床的な限界は、治療のブレークスルーを妨げます7。適切で現実的なex vivoモデルの確立は、GBMの8間および腫瘍内9の不均一性のために困難でした。
従来の2次元(2D)患者細胞株は、均質な細胞集団を表し、ハイスループットの薬物スクリーニングに適しています。しかし、患者由来および不死化細胞株は、増殖条件の違い、および複数の継代後の遺伝子型および表現型の特徴の逸脱により、GBMを適切に模倣することができません10,11,12。
一方、3Dオルガノイドモデルは、臓器やさまざまながんの表現型と分子の不均一性を再現する有望なシステムとして最近浮上しています13、14、15、16、17、18。膠芽腫の文脈では、大脳オルガノイドは、腫瘍様の特徴をシミュレートするように遺伝子組み換えされているか16,17、または腫瘍細胞浸潤を誘導するためにGSCまたはスフェロイドと共培養されています18,19。マトリゲルとEGF/bFGFで培養した患者由来のGBMオルガノイドは、幹細胞の不均一性や低酸素症などのGBMの特徴を示すが20、このモデルが患者の新生物の主要な分子特性をどの程度表すことができるかは不明のままである。
患者由来のGBMオルガノイド(PDO)は、組織学的特徴、細胞の多様性、遺伝子発現、および突然変異プロファイルなど、類似の親腫瘍の優勢な特徴を維持できる有望なモデルである。さらに、成体のげっ歯類の脳に移植されると急速に浸潤し、薬物検査と個別化治療の現実的なモデルを提供します21。しかし、腫瘍組織を手作業で解剖してPDOを生成するには、時間とコストがかかります。そのため、PDOを大量に生成し、さまざまな治療アプローチを包括的に評価できる迅速な方法が急務であり、個別化薬物試験が期待されています。この研究では、自動組織チョッパーを使用して、新たに切除された腫瘍組織から直接PDOを製造する新しい方法について説明します。さらに、この方法で生成されたPDOを、PDO数、形態学的特徴、アポトーシスおよび腫瘍細胞の増殖の観点から、同じ患者から手動で解剖したPDOと比較した。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究は、PDOを生成するための迅速かつ効率的な方法を提示します。膠芽腫は依然として治療が困難な腫瘍であり、しばしば再発と高い疾患負担を特徴としています3,6。in vitroで観察された有望な結果が、第I相試験ではin vivoで有効性を実証できないことが多いため、革新的な治療アプローチが緊急に必要とされています。この不一致の理由の1つは、単層培養で増殖した患者由来の不死化細胞株が、親腫瘍の複雑な細胞間相互作用および遺伝的特性を反映する能力が限られていることである可能性がある。GBM 8,9の腫瘍間および腫瘍内の不均一性が高いことを考えると、個別化された標的療法が好まれ、将来の用途に有望である可能性があります。2D接着細胞株とは対照的に、オルガノイドは親組織の特性を保持する能力を有する21が、腫瘍と正常な脳との間の複雑な細胞間相互作用が最も重要であり、このモデルでは見落とされる可能性がある。しかし、PDOを手作業で生成するのは時間のかかるプロセスであり、切断中にメスで絞ることによって引き起こされる組織の損傷は、PDOの成長をうまく妨げる可能性があります。そこで、組織チョッパーを使用して自動化された方法を最適化し、時間と労力を抑えてより多くのPDOを生成しました。さらに、全体的な増殖率とアポトーシス率が2つのアプローチ間で差ないことを示しました。
Cアプローチは単純で実装が容易で、より多くのPDOを生成できます(図3)。2回目と3回目のチョッピングの間の組織の回転は、プロトコルの重要なステップとして特定されました。この段階では、組織はすでに完全性を失っており、簡単にバラバラになり、その結果、顕微鏡下で追加の切断または手動解剖を必要とする大きな破片になる可能性があります。自動チョッパー法では、あらかじめ設定された切断サイズをより正確に行うことができますが、手動法ではPDOのサイズを決定する精度が低く、PDOの形状やサイズが不均一になり、比較薬物スクリーニングの欠点となります(図2)。しかし、提案手法ではPDOごとの細胞数の標準化が達成されておらず、標準化された薬物スクリーニングプロトコルの欠点となる可能性があります。異なるオルガノイド生成技術の長所と短所18、19、20、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、
37、38、39、40、41、42 およびそれらのアプリケーションを 表3にまとめます。
膠芽腫組織は、硬い組織(浸潤ゾーン)から柔らかい組織(壊死コア)まで、粘稠度が異なるため、自動チョッパーアプローチに課題が生じる可能性があります。組織が強すぎると、チョッパーが絞って損傷する可能性があり、柔らかすぎる組織は押しつぶされる可能性があります。選択された組織は、褐色または黄色の変色を呈するのではなく、散発的にピンクがかった灰色がかった色を特徴とする、中間レベルの硬さを含む独特の属性を示しました。海綿状で砕けやすいテクスチャーを有する組織は、アガロースブロック内で優れた保存性を示しましたが、非常に繊細で液化した腫瘍組織はサンプリング手順から除外されました。しかし、チョッパーアプローチでは、最適な一貫性の組織であっても、手動アプローチと比較して、より多くのPDOの生成に成功しました。重要な解決策は、腫瘍切除を行う外科医との緊密な相互作用を維持して、腫瘍のさまざまな領域から組織を処理することです。組織の一貫性が最適でない場合は、チョッピング後に顕微鏡下で組織を手動で作り直すことが役に立ちました。不均一性を考慮するために、腫瘍組織は最初に6つのセグメントに分割され、その後、CまたはMアプローチのいずれかで各セグメントが半分に分割されました。これら 6 つの異なるセクション内では、かなりのレベルの異質性が予想されます。さらに、同じセクションまたは井戸からのPDO内でさえ、異なる亜集団の存在はもっともらしいです。
概念実証として、増殖とアポトーシスのデータは、膠芽腫の患者2人とLGGの患者1人から報告され、2つの方法の間に有意差は見られませんでした。PDOの生成は、悪性度の高い脳腫瘍に限らず、LGGにも適用できます。この研究は、LGGが2D培養で成長を示すことはめったにないことを強調しており、彼らの研究のための正確なモデルの開発は非常に価値があります。このプロトコルは、GBMとLGGからPDOを迅速かつ効果的に生成する上で、このアプローチの汎用性を実証することを目的としています。
全体として、PDOは将来、悪性脳腫瘍における標的療法の患者指向の治療前試験に利用される可能性があります。腫瘍の進行が急速に進行し、救助治療の選択肢が切実に必要とされているため、個別化された薬物スクリーニングのための迅速かつ効率的な方法を提供することは非常に重要です。次のステップとして、PDOモデルをさまざまな免疫療法アプローチで評価し、実際の治療反応をよりよく模倣することができます。将来的には、PDOを利用して、臨床現場での治療法のさらなる探求と評価の必要性に関する高度な結論を導き出すことができます。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、学際的臨床研究センター(IZKF、B-450)ヴュルツブルク、バイエルンがん研究センター(BZKF)から資金提供を受け、出版物はヴュルツブルク大学のオープンアクセス出版基金の支援を受けました。技術サポートをしてくれたヴュルツブルク大学病院脳神経外科実験脳神経外科のDagmar Hemmerich氏とSiglinde Kühnel氏に感謝します。図 1 は www.biorender.com を使用して作成されました。
Materials
| 2-mercaptoethanol (1000x) | Gibco | 21985023 | |
| 30% formaldehyde methanol-free | Carl Roth | 4235.1 | Used in 4% concentration |
| 70% ethanol solution | For sterilisation | ||
| Agarose tablets 0.5 g | Carl Roth | HP67.7 | |
| Amphotericin B 250 µg/mL | Gibco | 15290018 | |
| Anatomical forceps | Hartstein | N/A | |
| Anatomical spatula | Hartstein | N/A | |
| B-27 Supplement without vitamin A (50x) | Gibco | 12587010 | |
| Biopsy cassette with cover | Resolab | 37001-b | |
| Blades for McIlwain Tissue Chopper | Campden instruments | Model TC752-1 | |
| CC3 antibody (Asp 175) | Cells signaling technology | 9661 | |
| Disposable scalpel | Feather | 0200130015 | |
| Distilled water | Gibco | 15230089 | To dilute the formaldehyd |
| Dulbecco's Modified Eagle Serum Nutrient Mixture (DMEM) F-12 (1:1) (1x) | Gibco | 11330032 | Includes L-Glutamine and 15 mM HEPES |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Sciences | D8537-500ML | Modified, without calcium, chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 433357 | |
| Falcon tube 50 ml Cellstar | Greiner Bio-One | 227261 | |
| GFAP antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc33673 | |
| Glass beaker | N/A | N/A | |
| Glass petri dish | N/A | N/A | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050061 | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo scientific | 51032875 | |
| Herasafe 2025 Biological Safety Cabinet | Thermo scientific | 5016643 | |
| Hibernate-A | Gibco | A1247501 | |
| Histoacryl glue | B. Braun surgical | 1050052 | |
| Human Insulin, Solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-360248 | |
| Ice box | N/A | N/A | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Cavey Laboratory Engineering | 51350V | |
| Microscope Leica DMI 3000B, DMI 4000B, DMI 6000B | Leica | DMI6000B | For brightfield and immunofluorescence pictures |
| Microscope stereozoom S9D | Leica | W841832 | For manual cutting and to organoids monitoring |
| Microwave | Bosch | N/A | To heat the agarose solution |
| Mounting plastic discs | Cavey Laboratory Engineering | 51354 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
| NEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) (100x) | Gibco | 11140050 | |
| Neurobasal (1x) | Gibco | 21103049 | |
| Orbital shaking machine Rotamax120 | Heidolph | 10304491 | |
| Penicilin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic petri dishes Cellstar | greiner bio-one | 628160 | n = 12 |
| Single channel pipette 1000 µm | Eppendorf | 4924000010 | |
| Single channel pipette 5000 µm | Eppendorf | EP3123000276 | |
| Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 23.0 | IBM | ||
| Surgipath Paraplast | Leica | 39601006 | Embedding medium |
| Ultra-low attachment Nucleon Sphera 6-well plate | Thermo Scientific | 174932 |
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