使用组织切碎器培养离体患者来源的神经胶质瘤类器官

所有患者均在德国维尔茨堡大学医院神经外科接受治疗，并根据赫尔辛基宣言并经维尔茨堡大学机构审查委员会批准（#22/20-me）给予书面知情同意书。从手术中获得来自 4 名 GBM 患者和 1 名星形细胞瘤、IDH 突变、CNS WHO 2 级患者（低级别胶质瘤，LGG）（表 1）的肿瘤组织材料，并使用以下方案进行处理。使用组织切碎器生成 PDO 的自动化过程称为切碎器 （C），在显微控制下用两把手术刀手动切割组织的过程称为手动 （M）。从肿瘤样本中解剖出六个大小相等的切片（1-2 cm3），然后将每个切成两半并使用两种方法均匀处理。由于上述肿瘤内异质性，每种方法从每位患者生成一个 6 孔板，每个孔代表来自原始肿瘤内不同部位的 PDO。这两种程序都在层流柜下进行，所有使用的器械在使用前都经过消毒。该方法的概述如 图 1 所示。 1. 制备琼脂糖嵌段（仅适用于C方法，可选） 将 50 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 填充到烧杯中，加入一片琼脂糖（参见 材料表），充分混合直至悬浮。 在微波炉中加热混合物 30-40 秒，同时避免沸腾。然后将混合物冷却至47°C。 将琼脂糖混合物倒入密封的圆柱形铸造模具中，避免形成任何气泡。立即使用冷冻（-20°C）夹子冷却铸件，或将其放在干冰上30分钟。 2.肿瘤材料的加工 准备一盒冰块，以保持肿瘤材料在从手术室到实验室的途中冷却。 将肿瘤组织（4-5cm³）转移到含有25mLHibernate A（参见 材料表）覆盖肿瘤的无菌50mL管中，并将管放入冰盒中。 在层流柜下，将肿瘤材料与Hibernate A一起转移到灭菌的玻璃培养皿中。 消除坏死组织，并在显微镜下使用手术刀和组织镊子仔细解剖血管。通过出血导致的褐色出血区域或相对于邻近活组织表现出更苍白或更白的组织来识别坏死组织。注意不要挤压或破坏组织。 将肿瘤材料切成六块，大小约为1-2厘米3。将碎片分配到预装有 3 mL H-GPSA 培养基（表 2）的塑料培养皿 （n = 6） 中，每个22.将培养皿放在冰上。 3. 设置纸巾切碎机 按照制造商手册23 中的说明放置刀片。 将切片厚度调整为 0.45-0.50 毫米。将刀片力设置为中等。将桌子释放旋钮固定为“启动”模式。 4. 处理肿瘤组织碎片 用斩波器处理肿瘤组织（C法）将琼脂糖块切成2厘米长的圆柱体，并使用组丙烯醇胶将其中一个圆柱体粘在切碎器圆形塑料皿上（参见 材料表）。 使用手术刀在琼脂糖圆柱体中加深，然后将第一个孔（步骤2.5）的肿瘤组织安装到该凹坑内。注意：应小心处理肿瘤材料，不要挤压或推入缝隙。间隙应足够大，以便轻松贴合肿瘤，但又要足够小，以便在切割过程中保持肿瘤材料稳定。步骤 4.1.1.和 4.1.2.是可选的。 将塑料圆盘放在切割台的安装圆盘上（请参阅 材料表）。 打开斩波器并按下重置按钮。斩波器现在开始切割（第一轮）。当工作台到达终点并将琼脂糖和肿瘤组织切割成所需的直径后，机器会自动停止。 将安装盘旋转 90°，然后将释放台旋钮调整到启动模式。 按 下复位 按钮，让机器再次切割组织，形成矩形组织（第二轮）。 取出装有处理过的材料的塑料盘，并使用组织刮刀小心地仅将肿瘤组织旋转 90°。 将塑料圆盘放在切割台上，然后将释放台旋钮调整到启动模式并按 下复位 按钮进行最后一轮切割（第三轮）。 关闭斩波器并取下塑料盘。清洁斩波器和刀片。 使用 5 mL 单通道移液器，将处理后的材料与培养基一起吸入移液器中，然后将悬浮液冲洗回培养皿中。 重复上一步 2-3 次以正确分离组织。 将培养皿放回冰上，并用每个肿瘤的其他 5 个培养皿重复步骤 （4.1.1-4.1.12.）。 手动处理肿瘤组织（M方法）将肿瘤组织从第一个塑料培养皿（步骤2.5）与3mL H-GPSA培养基（表2）一起转移到玻璃培养皿中。使用两把手术刀在显微镜下手动将该片段解剖成0.5mm的切片。 使用 2 mL 移液管将解剖的组织转移回其塑料培养皿。 对其他五个培养皿中的肿瘤切片重复步骤（4.2.1.-4.2.3.）（步骤2.5）。 5.清洗肿瘤组织 将每个培养皿向上倾斜至45°，等待30秒，直到肿瘤块沉入培养皿底部。 使用 1 mL 移液管小心吸出 2.5 mL H-GPSA 培养基（表 2），注意不要占用任何肿瘤组织。 向每个样品中加入 2 mL 红细胞裂解缓冲液（参见 材料表）。处理后的肿瘤片段必须完全被裂解缓冲液覆盖。 将6个培养皿放在实验室轨道振荡机上慢速10分钟。 小心吸出 2 mL 裂解缓冲液，以免占用任何肿瘤组织。 每次使用2mL H-GPSA培养基（表2）代替裂解缓冲液重复上述洗涤步骤（步骤5.1-5.5）两次。 6. 培养肿瘤组织 从每个培养皿中吸出 H-GPSA 培养基（表 2），并用 4 mL PDO 培养基（表 2）代替。 将每个培养皿的组织块转移到超低附着 6 孔板的一个相应孔中（参见 材料表）。 将板放在培养箱内的轨道振荡器上，并在37°C，5%CO2 和150rpm下孵育2-4周。 每两天更换一次半培养基，从每个孔中吸出 2 mL 培养基，并用预热至 37 °C 的 2 mL 新鲜 PDO 培养基（表 2）代替。 在显微镜下观察组织（形态、生长、中等颜色）并切割生长的 PDO （>0.7 mm） 或粘附组织以防止组织缺氧。为此，将 PDO 从超低附着孔转移到灭菌的玻璃培养皿中，并使用手术刀进行切割。或者，可以通过用 1 mL 移液管吸出粘性 PDO 来解析。注意不要挤压 PDO 并轻拿轻放。 通过每两天计数一次PDO来评估PDO的形成，并彻底检查所需的圆形形态（图2）。 7. 固定和嵌入 PDO 培养 6 周后，用 4% 福尔马林固定每个患者每个孔的两个 PDO 24 小时。 将固定的PDO浸入中性缓冲（磷酸钠）福尔马林中，直至包埋。 将每个PDO放入盒中（参见 材料表）进行进一步处理。 通过将暗盒浸入以下溶液中来启动脱水过程，如下注所述：注意：50%乙醇20分钟，70%乙醇20分钟，80%乙醇20分钟，96%乙醇20分钟，100%乙醇20分钟，100%乙醇30分钟，100%乙醇+氯仿（1：1比例）30分钟，100%乙醇+氯仿（1：1比例）30分钟，无水氯仿30分钟，无水氯仿30分钟， 石蜡 30 分钟，使用 STP 120 石蜡 30 分钟。 将脱水的PDO包埋在58-60°C的石蜡中。 将嵌入的PDO切片为2.5μm厚度，并将它们安装在载玻片上进行染色。 8. 免疫荧光染色 培养 6 周后挂载 PDO。 随后，对神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP，稀释度：1：100）和增殖标志物Ki67（稀释度：1：1000）进行双重染色（参见 材料表），如先前报道的22。 同样，通过对GFAP和抗caspase-3（CC3，稀释度：1：400）的PDO进行双重染色来评估细胞凋亡（参见 材料表）。 使用荧光显微镜以 40 倍放大倍率捕获 PDO 的图像。 分析 GFAP、Ki67 和 CC3 阳性细胞以及 GFAP/Ki67 和 GFAP/CC3 双阳性细胞的图像。 利用开源程序Fiji（ImageJ-win 32）进行图像分析。 9. 评估和数据分析 在标准设置和 5 倍放大倍率下在培养的第一周捕获每日显微明场图片。 观察形态变化，并跟踪手动和自动加工方法的成熟过程。 在标准明场模式设置下使用显微镜进行形态学分析。 评估所有 5 名患者在 PDO 培养的前 4 周内的 PDO 数量和形态。 从每位患者那里获得每个 PDO 计数的三个读数，以计算平均值和标准误差 （SEM）。 研究三名患者的 PDO 增殖和细胞凋亡。 使用市售的统计软件包分析数据（见 材料表）。 应用 Students-T 和 Mann-Whitney U 检验来确定手动和自动 PDO 生成在 PDO 计数、增殖和细胞凋亡方面的差异。