زراعة عضويات الورم الدبقي المشتقة من المريض خارج الجسم الحي باستخدام مفرمة الأنسجة
Summary
تقدم هذه الدراسة طريقة آلية لتوليد عضويات 3 الأبعاد للورم الأرومي الدبقي المشتق من المريض باستخدام مروحية الأنسجة. توفر الطريقة نهجا مناسبا وفعالا للحصول على هذه المواد العضوية للاختبار العلاجي.
Abstract
الورم الأرومي الدبقي ، IDH-wild type ، CNS WHO من الدرجة 4 (GBM) هو ورم دماغي أولي مرتبط بضعف بقاء المريض على قيد الحياة على الرغم من العلاج القوي. لا يزال تطوير نماذج واقعية خارج الجسم الحي يمثل تحديا. توفر نماذج الأعضاء ثلاثية الأبعاد (PDO) المشتقة من المريض منصات مبتكرة تلتقط عدم التجانس الظاهري والجزيئي ل GBM ، مع الحفاظ على الخصائص الرئيسية للأورام الأصلية. ومع ذلك ، فإن التشريح اليدوي لتوليد PDO يستغرق وقتا طويلا ومكلفا ويمكن أن يؤدي إلى عدد من PDOs غير المنتظمة وغير المتساوية الحجم. تقدم هذه الدراسة طريقة مبتكرة لإنتاج شركة تنمية نفط عمان باستخدام مفرمة الأنسجة الآلية. تمت معالجة عينات الورم من أربعة GBM وورم نجمي واحد ، IDH-mutant ، CNS WHO من الدرجة 2 يدويا وكذلك باستخدام مروحية الأنسجة. في النهج اليدوي ، تم تشريح مادة الورم باستخدام المشارط تحت التحكم المجهري ، بينما تم استخدام مروحية الأنسجة في ثلاث زوايا مختلفة. بعد الاستزراع على شاكر مداري عند 37 درجة مئوية ، تم تقييم التغيرات المورفولوجية باستخدام المجهر المجهري للمجال الساطع ، بينما تم تقييم الانتشار (Ki67) وموت الخلايا المبرمج (CC3) بواسطة التألق المناعي بعد 6 أسابيع. خفضت طريقة مفرمة الأنسجة ما يقرب من 70٪ من وقت التصنيع وأدت إلى ارتفاع كبير في متوسط عدد PDOs مقارنة بالأنسجة المعالجة يدويا من الأسبوع الثاني فصاعدا (الأسبوع 2: 801 مقابل 601 ، P = 0.018 ؛ الأسبوع 3: 1105 مقابل 771 ، P = 0.032 ؛ والأسبوع 4: 1195 مقابل 784 ، P < 0.01). كشف تقييم الجودة عن معدلات مماثلة من موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية وانتشارها لكلتا طريقتي التصنيع. لذلك ، توفر طريقة مفرمة الأنسجة الآلية نهجا أكثر كفاءة من حيث الوقت وعائد PDO. هذه الطريقة تبشر بالخير لفحص الأدوية أو العلاج المناعي لمرضى GBM.
Introduction
الأورام الدبقية منخفضة الدرجة (LGGs) هي مجموعة من أورام الدماغ النادرة نسبيا والتي تظهر عادة على أنها بطيئة النمو وأقل عدوانية مقارنة بالأورام الدبقية عالية الدرجة مثل الورم الأرومي الدبقي. يمكن أن تحدث في كل من البالغين والأطفال ، مع انتشار أعلى قليلا في البالغين. يختلف الانتشار الدقيق حسب المنطقة والسكان ، لكن LGGs تمثل حوالي 15٪ -20٪ من جميع أورام الدماغ الأولية1. غالبا ما تتضمن استراتيجيات علاج LGGs مزيجا من الجراحة والعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي ، بهدف تعظيم استئصال الورم مع الحفاظ على الوظيفة العصبية. يمكن أن تكون إدارة LGGs معقدة ، وقد يعتمد اختيار العلاج على عوامل مثل موقع الورم والخصائص الجزيئية2. أدى التقدم في فهم الأسس الجينية والجزيئية ل LGGs إلى علاجات أكثر استهدافا ، وتستمر الأبحاث الجارية لتحسين مناهج العلاج.
الورم الأرومي الدبقي ، IDH-wild type ، CNS WHO من الدرجة 4 (GBM) ، من ناحية أخرى ، هو ورم الدماغ الأولي الأكثر انتشارا الموجود لدى البالغين ، بمعدل حدوث يتراوح بين 3.19-4.17 حالة لكل 100000 شخص فيالسنة 3. يسبب GBM أعراضا مثل الصداع والنوبات والعجز العصبي البؤري والتغيرات في الشخصية وزيادة الضغط داخل الجمجمة. يتضمن العلاج القياسي ل GBM إزالة الورم ، إذا كان ذلك ممكنا ، يليه العلاج الإشعاعي جنبا إلى جنب مع Temozolomide4. علاوة على ذلك ، قد يؤدي الجمع بين تيموزولوميد ولوموستين إلى تعزيز متوسط معدل البقاء الإجمالي في المرضى الذين يعانون من مثيلة المروج O 6-methylguanine-methyltransferase (MGMT)5. ومع ذلك ، على الرغم من هذه الأساليب العلاجية الحديثة ، لا يزال GBM مرضا عضالا مع سوء التشخيص ، ويتميز بمتوسط معدل البقاء الإجمالي للمرضى من 16 شهرا إلى 20.9 شهرا عند إضافة مجالات علاج الورم (TTFields) 3,6. تم التحقيق في العديد من أساليب العلاج المناعي في GBM ولكنها أظهرت فعالية محدودة في الجسم الحي. علاوة على ذلك ، فإن القيود السريرية وما قبل السريرية تعيق الاختراقات العلاجية7. كان إنشاء نموذج مناسب وواقعي خارج الجسم الحي أمرا صعبا بسبب عدم التجانس بين 8 وداخل الورم9 ل GBM.
تمثل خطوط خلايا المريض التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) مجموعات خلايا متجانسة وهي مناسبة لفحص الأدوية عالي الإنتاجية. ومع ذلك ، فإن خطوط الخلايا المشتقة من المريض والخالدة تفشل في تقليد GBM بشكل كاف بسبب الاختلافات في ظروف النمو والانحرافات في السمات الوراثية والنمط الظاهري بعد مقاطع متعددة10،11،12.
من ناحية أخرى ، ظهرت نماذج 3D العضوية مؤخرا كأنظمة واعدة تكرر عدم التجانس الظاهري والجزيئي للأعضاء وأنواع السرطانالمختلفة 13،14،15،16،17،18. في سياق GBM ، تم تعديل الكائنات العضوية الدماغية وراثيا لمحاكاة الخصائص الشبيهة بالورم16,17 أو استزراعها مع GSCs أو كروية للحث على تسلل الخلايا السرطانية18,19. في حين أن عضويات GBM المشتقة من المريض المزروعة باستخدام Matrigel و EGF / bFGF تظهر سمات مميزة ل GBM مثل عدم تجانس الخلايا الجذعية ونقص الأكسجة20 ، لا يزال من غير المؤكد إلى أي مدى يمكن أن يمثل هذا النموذج الخصائص الجزيئية الرئيسية لأورام المرضى.
تعد عضويات GBM المشتقة من المريض (PDOs) نماذج واعدة يمكنها الحفاظ على السمات السائدة لأورام الوالدين المماثلة ، بما في ذلك الخصائص النسيجية ، والتنوع الخلوي ، والتعبير الجيني ، والملامح الطفرية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تسللها بسرعة عند زرعها في أدمغة القوارض البالغة ، مما يوفر نموذجا واقعيا لاختبار الأدوية والعلاج الشخصي21. ومع ذلك ، فإن تشريح أنسجة الورم يدويا لإنشاء PDOs يستغرق وقتا طويلا ومكلفا. لذلك ، توجد حاجة ملحة لطريقة سريعة يمكن أن تنتج أعدادا كبيرة من PDOs ، مما يتيح إجراء تقييم شامل للنهج العلاجية المختلفة التي تبشر بالخير لاختبار الأدوية الفردية. تصف هذه الدراسة طريقة جديدة لتصنيع PDOs مباشرة من أنسجة الورم التي تم تشريحها حديثا باستخدام مروحية الأنسجة الأوتوماتيكية. علاوة على ذلك ، تمت مقارنة PDOs الناتجة عن هذه الطريقة مع PDOs تشريح يدويا من نفس المرضى من حيث عدد PDO ، والسمات المورفولوجية ، وموت الخلايا المبرمج وتكاثر الخلايا السرطانية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم هذه الدراسة طريقة سريعة وفعالة لإنشاء PDOs. لا يزال GBM ورما صعبا للعلاج ، وغالبا ما يتميز بالانتكاس وعبء المرض المرتفع 3,6. هناك حاجة ماسة إلى نهج علاجية مبتكرة ، لأن النتائج الواعدة التي لوحظت في المختبر غالبا ما تفشل في إثبات فعاليتها في الجسم الحي أثناء تجارب المرحلة الأولى. قد يكون أحد أسباب هذا التناقض هو القدرة المحدودة لخطوط الخلايا الخالدة المشتقة من المريض ، والتي نمت في مزارع أحادية الطبقة ، لتعكس التفاعلات المعقدة بين الخلايا والخلايا والخصائص الوراثية للورم الأبوي. نظرا لعدم التجانس العالي بين الأورام وداخلها ل GBM 8,9 ، فإن العلاجات المستهدفة الشخصية مفضلة وقد تبشر بالخير للتطبيقات المستقبلية. على عكس خطوط الخلايا الملتصقة 2D ، تتمتع الكائنات العضوية بالقدرة على الاحتفاظ بخصائص الأنسجة الأبوية21 ، ومع ذلك فإن تفاعلات الخلايا الخلوية المعقدة بين الورم والدماغ الطبيعي لها أهمية قصوى ويمكن تجاهلها بواسطة هذا النموذج. ومع ذلك ، فإن التوليد اليدوي ل PDOs هو عملية تستغرق وقتا طويلا ، ويمكن أن يؤدي تلف الأنسجة الناجم عن الضغط بالمشارط أثناء القطع إلى إعاقة نمو PDO الناجح. لذلك ، تم تحسين طريقة آلية باستخدام مفرمة الأنسجة لتوليد أعداد أكبر من PDOs مع تقليل الوقت والجهد. بالإضافة إلى ذلك ، أثبتنا أن معدلات الانتشار وموت الخلايا المبرمج الإجمالية لم تختلف بين النهجين.
نهج C واضح ومباشر وسهل التنفيذ ويتيح إنشاء عدد أكبر من PDOs (الشكل 3). تم تحديد دوران الأنسجة بين الجولتين الثانية والثالثة من التقطيع كخطوة حاسمة في البروتوكول. في هذه المرحلة ، فقدت الأنسجة بالفعل سلامتها ويمكن أن تنهار بسهولة ، مما يؤدي إلى قطع أكبر تتطلب قطعا إضافيا أو تشريحا يدويا تحت المجهر. في حين أن نهج المروحية الآلية يسمح بحجم قطع محدد مسبقا بدقة أكبر ، فإن النهج اليدوي يفتقر إلى الدقة في تحديد حجم PDOs ، مما يؤدي إلى PDOs غير متساوية الشكل والحجم ، وهو عيب لفحص الأدوية المقارن (الشكل 2). ومع ذلك ، مع الطريقة المقترحة ، لم يتم تحقيق توحيد أرقام الخلايا لكل شركة تنمية نفط عمان ، مما قد يشكل عائقا لبروتوكولات فحص الأدوية الموحدة. مزايا وعيوب تقنيات توليد العضوية المختلفة18،19،20،24،25،26،27،28،29،30،31،32،33،34،35،36 ،
37،38،39،40،41،42 وتطبيقاتها ملخصة في الجدول 3.
يمكن أن تختلف أنسجة GBM في الاتساق ، بدءا من صلبة (منطقة التسلل) إلى لينة (قلب نخرية) ، والتي يمكن أن تشكل تحديات لنهج المروحية الآلية. إذا كان النسيج شديد الصلابة ، فقد تضغط عليه المروحية وتتلفه ، بينما قد يتم سحق الأنسجة الرخوة جدا. أظهر النسيج المختار سمات مميزة ، بما في ذلك مستوى متوسط من الصلابة ، يتميز بشكل متقطع بلون رمادي وردي بدلا من إظهار اللون البني أو الأصفر. أظهرت الأنسجة التي تمتلك نسيجا إسفنجيا ومتفتتا بسهولة حفظا فائقا داخل كتل الأغاروز ، في حين تم حذف أنسجة الورم الحساسة للغاية والمسيلة من إجراء أخذ العينات. ومع ذلك ، مكن نهج المروحية من توليد ناجح لعدد أكبر من PDOs مقارنة بالنهج اليدوي ، حتى مع وجود أنسجة ذات اتساق دون المستوى الأمثل. الحل الرئيسي هو الحفاظ على تفاعل وثيق مع الجراح الذي يقوم باستئصال الورم لمعالجة الأنسجة من مناطق مختلفة من الورم. في حالات تناسق الأنسجة دون المستوى الأمثل ، كانت إعادة صياغة الأنسجة يدويا تحت المجهر إضافة مفيدة بعد التقطيع. لحساب عدم التجانس ، تم تقسيم أنسجة الورم في البداية إلى ستة أجزاء ، تم تقسيم كل منها لاحقا إلى النصف إما لنهج C أو M. ضمن هذه الأقسام الستة المتميزة ، من المتوقع وجود درجة كبيرة من عدم التجانس. علاوة على ذلك ، حتى داخل PDOs من نفس القسم أو البئر ، فإن وجود مجموعات فرعية متميزة أمر معقول.
كدليل على المفهوم ، تم الإبلاغ عن بيانات الانتشار وموت الخلايا المبرمج من مريضين مصابين ب GBM ومريض واحد مصاب ب LG ، والتي لا تظهر فروقا ذات دلالة إحصائية بين الطريقتين. لا يقتصر توليد PDOs على أورام الدماغ الخبيثة للغاية ولكن يمكن أيضا تطبيقه على LGGs. تسلط هذه الدراسة الضوء على أن LGG نادرا ما تظهر نموا في ثقافة 2D ، مما يجعل تطوير نموذج دقيق لدراستهم ذا قيمة عالية. يهدف هذا البروتوكول إلى إظهار براعة هذا النهج في إنشاء PDOs من GBM وكذلك LGG بسرعة وفعالية.
بشكل عام ، يمكن استخدام PDOs في المستقبل لإجراء اختبار ما قبل العلاج الموجه للمريض للعلاجات المستهدفة في أورام الدماغ الخبيثة. يعد توفير طريقة سريعة وفعالة لفحص الأدوية الفردية أمرا بالغ الأهمية ، حيث يحدث تطور الورم بسرعة ، وهناك حاجة ماسة إلى خيارات علاج الإنقاذ. وكخطوة تالية، يمكن تقييم نموذج شركة تنمية نفط عمان من خلال مناهج علاجية مناعية مختلفة لمحاكاة استجابات العلاج الحقيقية بشكل أفضل. في المستقبل ، يمكن استخدام PDOs لاستخلاص استنتاجات معقدة فيما يتعلق بالحاجة إلى مزيد من الاستكشاف وتقييم العلاجات في بيئة سريرية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل المركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (IZKF ، B-450) فورتسبورغ ، المركز البافاري لأبحاث السرطان (BZKF) والمنشور المدعوم من صندوق النشر المفتوح التابع لجامعة فورتسبورغ. نود أن نشكر داغمار هيمريش وسيغليند كونيل ، كلاهما قسم جراحة الأعصاب التجريبية ، قسم جراحة المخ والأعصاب ، مستشفى جامعة فورتسبورغ ، على الدعم الفني. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام www.biorender.com.
Materials
| 2-mercaptoethanol (1000x) | Gibco | 21985023 | |
| 30% formaldehyde methanol-free | Carl Roth | 4235.1 | Used in 4% concentration |
| 70% ethanol solution | For sterilisation | ||
| Agarose tablets 0.5 g | Carl Roth | HP67.7 | |
| Amphotericin B 250 µg/mL | Gibco | 15290018 | |
| Anatomical forceps | Hartstein | N/A | |
| Anatomical spatula | Hartstein | N/A | |
| B-27 Supplement without vitamin A (50x) | Gibco | 12587010 | |
| Biopsy cassette with cover | Resolab | 37001-b | |
| Blades for McIlwain Tissue Chopper | Campden instruments | Model TC752-1 | |
| CC3 antibody (Asp 175) | Cells signaling technology | 9661 | |
| Disposable scalpel | Feather | 0200130015 | |
| Distilled water | Gibco | 15230089 | To dilute the formaldehyd |
| Dulbecco's Modified Eagle Serum Nutrient Mixture (DMEM) F-12 (1:1) (1x) | Gibco | 11330032 | Includes L-Glutamine and 15 mM HEPES |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Sciences | D8537-500ML | Modified, without calcium, chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 433357 | |
| Falcon tube 50 ml Cellstar | Greiner Bio-One | 227261 | |
| GFAP antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc33673 | |
| Glass beaker | N/A | N/A | |
| Glass petri dish | N/A | N/A | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050061 | |
| Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo scientific | 51032875 | |
| Herasafe 2025 Biological Safety Cabinet | Thermo scientific | 5016643 | |
| Hibernate-A | Gibco | A1247501 | |
| Histoacryl glue | B. Braun surgical | 1050052 | |
| Human Insulin, Solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-360248 | |
| Ice box | N/A | N/A | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Cavey Laboratory Engineering | 51350V | |
| Microscope Leica DMI 3000B, DMI 4000B, DMI 6000B | Leica | DMI6000B | For brightfield and immunofluorescence pictures |
| Microscope stereozoom S9D | Leica | W841832 | For manual cutting and to organoids monitoring |
| Microwave | Bosch | N/A | To heat the agarose solution |
| Mounting plastic discs | Cavey Laboratory Engineering | 51354 | |
| N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
| NEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) (100x) | Gibco | 11140050 | |
| Neurobasal (1x) | Gibco | 21103049 | |
| Orbital shaking machine Rotamax120 | Heidolph | 10304491 | |
| Penicilin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Plastic petri dishes Cellstar | greiner bio-one | 628160 | n = 12 |
| Single channel pipette 1000 µm | Eppendorf | 4924000010 | |
| Single channel pipette 5000 µm | Eppendorf | EP3123000276 | |
| Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 23.0 | IBM | ||
| Surgipath Paraplast | Leica | 39601006 | Embedding medium |
| Ultra-low attachment Nucleon Sphera 6-well plate | Thermo Scientific | 174932 |
References
- Gatto, L., et al. IDH inhibitors and beyond: the cornerstone targeted glioma treatment. Mol Diagn Ther. 25 (4), 457-473 (2021).
- Buckner, J. C., et al. Radiation plus Procarbazine, CCNU, and Vincristine in low-grade glioma. N Engl J Med. 374 (14), 1344-1355 (2016).
- Grochans, S., et al. Epidemiology of glioblastoma multiforme-literature review. Cancers (Basel). 14 (10), 2412 (2022).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma). N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
- Herrlinger, U., et al. Lomustine-temozolomide combination therapy versus standard temozolomide therapy in patients with newly diagnosed glioblastoma with methylated MGMT promoter (CeTeG/NOA-09): a randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 393 (10172), 678-688 (2019).
- Stupp, R., et al. Effect of tumor-treating fields plus maintenance temozolomide vs maintenance temozolomide alone on survival in patients with glioblastoma: a randomized clinical trial. Jama. 318 (23), 2306-2316 (2017).
- Desbaillets, N., Hottinger, A. F. Immunotherapy in glioblastoma: a clinical perspective. Cancers (Basel). 13 (15), 3721 (2021).
- Gularyan, S. K., et al. Investigation of inter- and intratumoral heterogeneity of glioblastoma using TOF-SIMS). Mol Cell Proteomics. 19 (6), 960-970 (2020).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).
- Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).
- Timerman, D., Yeung, C. M. Identity confusion of glioma cell lines. Gene. 536 (1), 221-222 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Bian, S., et al. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nat Methods. 15 (8), 631-639 (2018).
- Ogawa, J., Pao, G. M., Shokhirev, M. N., Verma, I. M. Glioblastoma model using human cerebral organoids. Cell Rep. 23 (4), 1220-1229 (2018).
- Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Rep. 26 (12), 3203-3211 (2019).
- da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion. SLAS Discov. 23 (8), 862-868 (2018).
- Hubert, C. G., et al. A three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo. Cancer Res. 76 (8), 2465-2477 (2016).
- Jacob, F., et al. A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity. Cell. 180 (1), 188-204 (2020).
- Nickl, V., et al. Glioblastoma-derived three-dimensional ex vivo models to evaluate effects and efficacy of tumor treating fields (TTFields). Cancers (Basel). 14 (21), 5177 (2022).
- Klein, E., Hau, A. C., Oudin, A., Golebiewska, A., Niclou, S. P. Glioblastoma organoids: pre-clinical applications and challenges in the context of immunotherapy. Front Oncol. 10, 604121 (2020).
- Golebiewska, A., et al. Patient-derived organoids and orthotopic xenografts of primary and recurrent gliomas represent relevant patient avatars for precision oncology. Acta Neuropathol. 140 (6), 919-949 (2020).
- Bougnaud, S., et al. Molecular crosstalk between tumour and brain parenchyma instructs histopathological features in glioblastoma. Oncotarget. 7 (22), 31955-31971 (2016).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nat Cell Biol. 16 (10), 951-954 (2014).
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. J Neurosci Methods. 59 (1), 5-9 (1995).
- Kato, H., Ogawa, T. A technique for preparing in vitro slices of cat’s visual cortex for electrophysiological experiments. J Neurosci Methods. 4 (1), 33-38 (1981).
- Teyler, T. J. Brain slice preparation: hippocampus. Brain Res Bull. 5 (4), 391-403 (1980).
- Schulz, E., et al. Preparation and culture of organotypic hippocampal slices for the analysis of brain metastasis and primary brain tumor growth. Methods Mol Biol. 2294, 59-77 (2021).
- Driehuis, E., Gracanin, A., Vries, R. G. J., Clevers, H., Boj, S. F. Establishment of pancreatic organoids from normal tissue and tumors. STAR Protoc. 1 (3), 100192 (2020).
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Neal, J. T., et al. Organoid modeling of the tumor immune microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Li, X., et al. Oncogenic transformation of diverse gastrointestinal tissues in primary organoid culture. Nat Med. 20 (7), 769-777 (2014).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).
- Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2, 94 (2022).
- Toh, Y. C., et al. A novel 3D mammalian cell perfusion-culture system in microfluidic channels. Lab Chip. 7 (3), 302-309 (2007).
- Zhang, C., Zhao, Z., Abdul Rahim, N. A., van Noort, D., Yu, H. Towards a human-on-chip: culturing multiple cell types on a chip with compartmentalized microenvironments. Lab Chip. 9 (22), 3185-3192 (2009).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nat Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Kengla, C., Atala, A., Sang Jin, L. Bioprinting of organoids. Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 271-282 (2015).
