JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Автоматизированное вибратомное секционирование легочной ткани, внедренной агарозой, для мультиплексной флуоресцентной визуализации

Published: October 06, 2023
doi:
10.3791/65943
, ,
1Wallenberg Centre for Molecular Medicine,Lund University, 2Department of Clinical Sciences,Lund University, 3Lund Stem Cell Centre,Lund University, 4Department of Cardiothoracic Surgery and Transplantation,Skåne University Hospital

Summary

Мы разработали технику обработки тканей с использованием вибратома и легочной ткани, внедренной агарозой, для создания срезов легких, что позволяет получать изображения архитектуры легких с высоким разрешением. Мы использовали иммунофлуоресцентное окрашивание для наблюдения за пространственной экспрессией белка с использованием специфических структурных маркеров легких.

Abstract

Из-за присущей ему структурной хрупкости легкое считается одной из наиболее сложных тканей для микроскопических исследований. Чтобы добавить структурную поддержку для секционирования, кусочки легочной ткани обычно помещают в парафин или ОКТ-соединение и разрезают с помощью микротома или криостата соответственно. Более современный метод, известный как прецизионные срезы легких, добавляет структурную поддержку свежей легочной ткани за счет агарозной инфильтрации и обеспечивает платформу для поддержания первичной легочной ткани в культуре. Однако из-за маскировки эпитопов и искажения тканей ни один из этих методов не подходит для разработки воспроизводимых улучшенных световых изображений, которые были бы совместимы с различными антителами и видами.

С этой целью мы разработали конвейер обработки тканей, в котором используется агарозное встраивание фиксированной легочной ткани в сочетании с автоматизированным вибратомным секционированием. Это способствовало получению участков легких толщиной от 200 мкм до 70 мкм в легких мыши, свиньи и человека, которые не требуют извлечения антигена и представляют собой наименее «обработанную» версию нативной изолированной ткани. Используя эти срезы, мы получаем мультиплексную визуализацию, способную генерировать изображения с высоким разрешением, пространственная экспрессия белка которых может быть использована для количественной оценки и лучшего понимания механизмов, лежащих в основе повреждения и регенерации легких.

Introduction

Срезы легочной ткани ex vivo широко используются при изучении заболеваний легких1. Современные золотые стандарты, особенно в клинических и трансляционных исследованиях на крупных животных, используют окрашивание гематоксилином и эозином в сочетании со светлопольной микроскопией и оценкой на основе наблюдателя для оценки и оценки дисфункции легких 2,3. Несмотря на то, что это по-прежнему ценный метод, он имеет ограничения с точки зрения пространственного разрешения и количества маркеров, которые могут быть изображены одновременно. Кроме того, легочная ткань должна подвергаться обширной промывке на основе растворителей, что приводит к обезвоживанию, усадке и регидратации ткани перед ее окончательной визуализацией4. Этот процесс не только отнимает много времени, но и вреден для окружающей среды, маскирует белковые эпитопы и может вызвать структурные изменения тканей 5,6,7,8. Тем не менее, для легочной ткани встраивание в парафин перед секционированием было необходимым из-за структурной хрупкости легкого. Напротив, твердые органы, такие как головной мозг, могут быть разрезаны с помощью вибрирующего микротома (вибратома), как в фиксированных, так и в свежих тканях 9,10,11,12.

Для обеспечения возможности вибратомного секционирования в легочной ткани был разработан метод, называемый прецизионными срезами легких (PCLS), при котором агароза с низкой температурой плавления вводится в свежую легочную ткань через дыхательные пути или кровеносные сосуды и оставляется для затвердевания13,14. Агароза в дыхательных путях обеспечивает достаточную структурную поддержку, позволяющую затем проводить секцию вибратома 9,14. У грызунов этого легко достичь, так как агарозу можно вводить через трахею; Тем не менее, в тканях свиней и человека может быть сложно найти подходящие дыхательные пути/сосуд в рамках данной биопсии15,16. Более того, даже если такие дыхательные пути/сосуды расположены, для введения агарозы обычно требуется значительное усилие, что может повлиять на последующую морфологию легких17.

Чтобы преодолеть проблемы, возникающие при внедрении/секционировании/окрашивании парафинов и рабочем процессе PCLS, мы создали новый конвейер обработки фиксированной легочной ткани. Этот рабочий процесс позволяет использовать вибратом для секционирования, может производить более тонкие срезы, чем в PCLS, и получать срезы, которые не требуют извлечения антигена для мультиплексной флуоресцентной визуализации. Этот метод предлагает средства «наименьшей обработки» для создания срезов легких, которые могут быть использованы в современной световой микроскопии. Кроме того, считывание изображений может быть использовано для демонстрации пространственных отношений клеток и анатомических структур в легочной ткани путем захвата объемной архитектуры ткани 18,19,20,21. В этой статье описывается протокол создания этих срезов легких и демонстрируется мультиплексное окрашивание, применяемое к каждой из этих тканей, и то, как эти расширенные данные визуализации могут быть использованы для количественной оценки.

Protocol

Легкие мышей были пожертвованы исследователями, использующими другие системы органов, в попытке поддержать 3R. Все процедуры у свиней проводились в соответствии с европейской директивой 2010/63/EU и были одобрены Этическим комитетом Мальмё-Лунда по исследованиям на животных (Dnr 5.8.18-05527/2019) и проведены в соответствии с руководящими принципами CODEX Шведского исследовательского совета. Разрешение на использование образцов на людях было выдано Шведским национальным комитетом по этике (Dnr 2020-07115 и Dnr 2020-01864). Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами и инструментами, используемыми в этом протоколе. 1. Приготовление растворов и материалов Зафиксируйте легочную ткань в 4% параформальдегиде при комнатной температуре в течение 48 ч. Затем переносят легочную ткань в коническую пробирку объемом 50 мл, заполненную фосфатно-солевым буфером (PBS), содержащим 0,01% азида натрия. Приготовьте 3%-ный (массовый) раствор агарозы, растворив 1,5 г агарозы с низкой температурой плавления в 50 мл стерильного ПБС. Приготовьте пластиковый стаканчик, тонкие щипцы и стерильные ножницы. Нагрейте агарозу в микроволновой печи до кипения, затем остудите ее до 42 °C на водяной бане. Храните агарозу в жидком виде, храня ее на водяной бане до тех пор, пока она не будет готова к использованию.ПРИМЕЧАНИЕ: Нагревая агарозу, следите за микроволновой печью, пока она не закипит, чтобы она не переполнилась. Обычно это занимает около 1,5 минут. 2. Легочная ткань, внедренная в агарозу Поднимите биопсию легкого из PBS-азида и осторожно рассеките доли легких с помощью тонких щипцов и стерильных ножниц. Разрежьте легочную долю на более мелкие блоки.ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что секция с помощью плевры возможна, ее толстые пучки эластина могут препятствовать резке вибратомным лезвием. Таким образом, мы рекомендуем удалить его, если в этом нет необходимости. Разрежьте пластиковый стаканчик посередине и добавьте на его дно небольшое количество агарозы. Поместите крышку из конической пробирки объемом 50 мл (ободок снят) на поверхность агарозы и храните чашку при температуре 4 °C в течение 5 минут, чтобы агароза затвердела для последующего использования. Достаньте пластиковый стаканчик из холодильника с температурой 4 °C, добавьте примерно 1 мл жидкой агарозы на крышку, затем аккуратно поместите блок легочной ткани на крышку. Оставьте агарозу на 2-3 минуты для полузастывания при комнатной температуре. Затем медленно вылейте жидкую агарозу на легочную ткань до полного погружения. Охладите при температуре 4 °C примерно на 15 минут, пока агароза не затвердеет. Затем осторожно острым лезвием удалите излишки агарозы, окружающие легочную ткань, оставив вокруг ткани однородный слой толщиной около 5 мм (рисунок 1). 3. Разрезание срезов легочной ткани Чтобы подготовить легочную ткань к секционированию, прикрепите каждый тканевый блок к диску образца вибратома с помощью суперклея. Затем наполните буферный лоток вибратома PBS и поместите лед в окружающую ледяную ванну. Наконец, осторожно установите диск с образцами в буферный лоток. Срез легочной ткани вибратомом со следующими настройками: толщина: 200 мкм, частота: 100 Гц, амплитуда лезвия: 1,3 мм, и поступательная скорость лезвия 0,02-0,03 мм/с, которая зависит от жесткости ткани.ПРИМЕЧАНИЕ: Резка возможна до толщины до 70 мкм, если скорость лезвия снижена до 0,01 мм/с. Некоторые вибратомы (например, Leica V1200) позволяют автоматизировать секционирование путем установки окна резки. Чтобы собрать срезы, аккуратно перенесите срез ткани, зачерпнув его щеткой из вибратомного лотка в 24-луночную пластину, заполненную 0,01% азидом в PBS. Наконец, храните срезы легких при температуре 4 °C. 4. Иммуноокрашивание эластина, CD31, HTII-280 и СМА Пермеабилизацию и блокирование (1% бычий сывороточный альбумин + 0,5% тритон + 5% обычная козья сыворотка) ткани при 4 °C при легком встряхивании в течение 45 мин. Разбавляют первичные антитела (СМА 1:500; эластин 1:250; КД31 1:250; HTII-280 1:250) в PBS, добавляют 300 мкл в лунку и инкубируют в течение ночи при 4 °C при легком встряхивании. Не прикасаясь к срезу и не удаляя первичные антитела наконечником пипетки, промыть 3 x 20 мин (400 мкл) PBS. Вторичные антитела (1:1000) разводят в PBS, добавляют 300 мкл в лунку и инкубируют при 4 °C при легком встряхивании в течение 90 мин. Удалите вторичные антитела с помощью наконечника пипетки, добавьте 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) (1:1000) и томатный лектин-488 (1:500) в течение 30-минутной инкубации и промывайте в течение 3 x 10 минут PBS. Нанесите три капли монтажной среды на предметное стекло, установите покровный стекло и приступайте к визуализации.

Representative Results

Процесс создания срезов легочной ткани включает в себя несколько ключевых этапов, включая подготовку, встраивание и секционирование. Раствор агарозы (3% (по массе) получают путем растворения 1,5 г агарозы с низкой температурой плавления в 50 мл стерильного ПБС. Необходимые расходные материалы включают пластиковый стаканчик, крышку от конической пробирки объемом 50 мл (без ободка), щипцы и ножницы. Легочная ткань тщательно разрезается на более мелкие блоки тонкими щипцами и стерильными ножницами (рис. 1А,Б). Далее для встраивания блоков легочной ткани дно чашки заполняют небольшим количеством агарозы, на поверхность агарозы помещают крышку, и чашку хранят при 4 °С в течение 5 мин (рис. 1С). В крышку добавляют примерно 1 мл жидкой агарозы и помещают на крышку блок легочной ткани. Агарозу оставляют на 2-3 мин для полузастывания при комнатной температуре (рис. 1D). После того, как блокада легких удерживается на месте полузатвердевшей агарозой, жидкая агароза затем заливается в чашку до тех пор, пока блокада легочной ткани не будет полностью погружена. Его хранят при температуре 4 °C в течение 15 минут (рис. 1E, F). Внедрение агарозы с низкой температурой плавления обеспечивает необходимую поддержку и жесткость легочной ткани, что помогает сохранить ее первоначальную архитектуру в процессе срезания. Острое лезвие используется для удаления излишков агарозы, окружающих легочную ткань. Вокруг ткани остается однородный слой толщиной около 5 мм (Рисунок 1G). Затем иссеченный блок легочной ткани аккуратно приклеивается к держателю ткани (Рисунок 1H). Вибратомный буферный лоток заполняется PBS, лед помещается в окружающую ледяную ванну, а диск для образцов устанавливается в буферный лоток (рис. 1I). Параметры вибратомной резки, установленные на панели: толщина среза: 200 мкм; частота: 100 Гц; амплитуда лезвия: 1,3 мм; поступательная скорость лезвия: 0,02-0,03 мм/с, что зависит от жесткости ткани (рис. 1J). Наконец, окрашивание осуществляется на свободно плавающих срезах (рис. 1К-М). Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили на срезах по 200 мкм от каждого вида на гладкомышечный актин (СМА, гладкомышечная клетка и маркер миофибробластов), эластин (белок внеклеточного матрикса) и лектин Lycopersicon Esculentum (LEA), который связывается с клетками бронхоальвеолярного эпителия. Легкое представляет собой структурно гетерогенную ткань, и поэтому дифференциальное распределение СМА и эластина наблюдается в структурах, включая альвеолярные протоки, кровеносные сосуды, внутрилегочные бронхиолы и альвеолы мышей, свиней и человека (рис. 2A-L). Визуализация бронхиолы размером 20 мкм с высоким разрешением показывает, как тонкие структуры в легком могут быть исследованы на полутрехмерном уровне (Дополнительное видео S1). В качестве количественного примера, используя трассировку изображений, мы показываем, как размер альвеол различается между образцами (n = 20 альвеол) (рис. 2L,M). Чтобы показать, как можно количественно использовать эти передовые данные визуализации, мы сравнили распределение клеток пневмоцитов 2-го типа (TII) в легочной ткани человека у взрослого и младенца. Специфическое для человека антитело к альвеолярным клеткам 2-го типа, HTII-280, обладает сильным сродством к поверхности клеток человека 2-го типа (рис. 3A-F). Эти клетки в дальнейшем можно рассматривать в трехмерном пространстве одной альвеолы с помощью объемной визуализации (Supplemental Video S2). Чтобы количественно оценить количество TII между взрослыми и младенцами, мы обработали количество HTII-280 в 10 случайных полях зрения (FOV). Между этими образцами в образце младенцев было выявлено значительно более высокое количество клеток TII (рис. 3G). Тем не менее, младенческая выборка также продемонстрировала значительно более высокий охват каркасом, чем взрослый, что может объяснить более высокое количество клеток (рис. 3H). Чтобы учесть это, мы оценили количество ТИИ, основанное на покрытии каркасом, в количестве клеток намм2 ткани, что по-прежнему поддерживало значительно большее количество ТИИ в образце младенца (рис. 3I). Таким образом, более высокий уровень TII в выборке младенцев не связан с увеличением покрытия каркасом и подчеркивает важность оценки распределения клеток в легких на основе площади каркаса, а не общего поля зрения. Рисунок 1: Протокол нарезки срезов легочной ткани. (А) Растворы и материалы: 3%-ный (массовый) раствор агарозы, полученный путем растворения 1,5 г агарозы с низкой температурой плавления в 50 мл стерильного фосфатно-солевого буфера; пластиковый стаканчик; крышка из конической пробирки объемом 50 мл; щипцы и ножницы. (Б) Легочную ткань рассекали с помощью тонких щипцов и стерильных ножниц. (C) Наполните дно чашки небольшим количеством агарозы и положите крышку на поверхность агарозы; затем храните его при температуре 4 °C в течение 5 минут. (D) Медленно добавьте 1-2 мл жидкой агарозы в крышку, осторожно положите кусочек легочной ткани на крышку и храните при температуре 4 °C в течение 2 минут. (E, F) Налейте жидкую агарозу в чашку до полного погружения в кусочек легочной ткани, храните при температуре 4 °C в течение 15 минут, а затем аккуратно разбейте пластиковый стаканчик. (G) Используйте острое лезвие, чтобы удалить избыток агарозы, окружающей легочную ткань, оставив вокруг ткани однородный слой толщиной около 5 мм. (H) Затем иссеченный блок легочной ткани аккуратно приклеивается к держателю ткани. (I) Наполните буферный лоток вибратома PBS, поместите лед в окружающую ледяную ванну и установите диск для образцов в буферный лоток. (J) Установите параметры резки на панели вибратома; толщина среза: 200 мкм, частота: 100 Гц, амплитуда ножа: 1,3 мм, поступательная скорость лезвия 0,02-0,04 мм/с. (К-М) Репрезентативные изображения свободно плавающего среза, все еще погруженного в агарозу и готового к иммунофлуоресцентному окрашиванию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Иммунофлуоресцентные изображения структуры легких человека, свиньи и мыши. (А-Л) Репрезентативные изображения альвеолярного протока, кровеносного сосуда, бронхиолы и альвеол в срезах легочной ткани мыши, свиньи и человека соответственно. СМА (показана зеленым цветом) является маркером гладкомышечных клеток и наблюдается в сосудистой и бронхиальной стенках легочной ткани. Эластин (показан красным цветом) входит в состав внеклеточного матрикса легких. (M) Количественная оценка альвеолярного размера путем выбора 20 случайных позиций на каждом срезе легочной ткани для образцов человека, свиньи и мыши. Гистограммы были использованы для иллюстрации распределения альвеолярных размеров в каждой группе. Масштабные линейки = 50 мкм (A-F, H-L), 100 мкм (G). Тест Краскалла-Уоллиса. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Сокращения: DAPI = 4′,6-диамидино-2-фенилиндол; LEA = лектин Lycopersicon Esculentum; СМА = гладкомышечный актин; мс = мышь; HMN = человек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3. Распределение пневмоцитов 2 типа в образцах взрослого и младенческого человека. (А,Б) Репрезентативные изображения легочной ткани человека у взрослых и младенцев, окрашенных на HTII-280 (красный), CD31 (зеленый цвет) и LEA (серый). (С,Д) Репрезентативные изображения взрослого и младенческого человека, показывающие только распределение пневмоцитов 2-го типа. (Д,Ж) Репрезентативные изображения отдельных пневмоцитов 2-го типа с одноклеточным разрешением из образцов легких взрослого и младенческого человека. (G) Количественная оценка количества пневмоцитов типа 2 между образцами взрослого и младенца. (H) Количественная оценка площади каркаса легочной ткани (% по сравнению с воздухом) в образцах взрослых и младенцев. (I) Количественное определение уровня пневмоцитов типа 2 намм2 ткани в образцах для взрослых и младенцев. Масштабные линейки = 5 мкм (E,F), 100 мкм (A-D). n = 10 FOV на выборку. Непарный t-критерий или критерий Манна-Уитни. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Сокращения: DAPI = 4′, 6-диамидино-2-фенилиндол; LEA = лектин Lycopersicon Esculentum; HTII = клетки человека II типа; CD31 = молекула адгезии эндотелиальных клеток тромбоцитов-1/кластер дифференцировки 31; FOV = поле зрения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительное видео S1: Видео с визуализацией объема 20 мкм одного дыхательного пути свиньи, окрашенного с помощью DAPI, LEA, SMA и эластина, показывающее изображение структуры элементов стенки дыхательных путей с высоким разрешением. Сокращения: DAPI = 4′,6-диамидино-2-фенилиндол; LEA = лектин Lycopersicon Esculentum; СМА = гладкомышечный актин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл. Дополнительное видео S2: Видео с изображением объема 30 мкм одной альвеолы, окрашенной с помощью DAPI, LEA и HTII-280, показывающее распределение пневмоцитов 2-го типа по структуре. Сокращения: DAPI = 4′,6-диамидино-2-фенилиндол; LEA = лектин Lycopersicon Esculentum; СМА = гладкомышечный актин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

В этом протоколе мы представляем усовершенствованный метод генерации срезов легких на основе вибратомы. По сравнению с методами обработки на основе парафина, этот метод является более экономичным, эффективным по времени и более безопасным для окружающей среды22. Кроме того, этот метод помогает сохранить структурную целостность срезов легочной ткани и позволяет проводить расширенную иммунофлуоресцентную визуализацию без необходимости извлечения антигена. Однако в ходе наших экспериментов мы также обнаружили определенные ограничения в этом рабочем процессе. Больные легкие могут мешать процессу резания из-за разрушения тканей, вызванного патологическими изменениями. При использовании вибратома для секционирования обструкция дыхательных путей и тяжелая фиброзная легочная ткань могут препятствовать лезвию, что усложняет процесс разрезания этих тканей. Однако это можно преодолеть, уменьшив скорость лезвия и поддерживая ткань тонкой кистью. Аналогичные проблемы возникают из-за утолщения плевры, которое является распространенным исходом при плеврите, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) и идиопатическом легочном фиброзе (ИЛФ)23,24,25. Если плевра не представляет интереса для эксперимента, мы рекомендуем удалить ее перед секцией или изолировать объем легких от плевры. Если плевра необходима, то ее можно разрезать, используя аналогичную манипуляцию, как описано выше, с использованием более медленных скоростей лезвия и поддержки ломтика тонкой щеткой.

Несмотря на то, что прецизионно вырезанные срезы легких могут сохранить трехмерную архитектуру и естественную среду легкого26, важно отметить, что создание PCLS является сложным и трудоемким процессом. Успех генерации срезов легочной ткани во многом зависит от эффективности агарозного наполнения, на которое, в свою очередь, влияет наличие интактной плевры и жизнеспособных мест инъекций в полученной ткани. Это легко достижимо у грызунов, так как агароза может легко вводиться через трахею в интактные легкие27,28,29. Тем не менее, в исследованиях на крупных животных биопсия обычно берется из дистальных сегментов легких, у которых нет достаточно больших дыхательных путей для канюляции30,31. Таким образом, вместо инъекций агарозы в бронхи или кровеносные сосуды, мы применяем этот метод, при котором легочная ткань, независимо от вида происхождения или объема образца, помещается в агарозу с низкой температурой плавления для получения срезов легочной ткани. Этот подход технически проще и направлен на то, чтобы свести к минимуму повреждение тканей настолько, насколько это возможно. Исходя из нашего опыта, этот метод продемонстрировал более высокую эффективность и простоту в генерации срезов легочной ткани. Он эффективно сохраняет морфологию альвеол и особенно подходит для разрезания легочной ткани, позволяя создавать воспроизводимые мультиплексные флуоресцентные изображения высокого разрешения.

В этом исследовании мы дополнительно демонстрируем две количественные оценки полученных данных визуализации на основе выборки. В первом исследовании использовалась трассировка изображений для оценки различий в альвеолярном размере между образцами видов. Неудивительно, что альвеолы мышей были самыми маленькими, в то время как альвеолы свиньи и человека были похожи по размеру, что подчеркивает свиней как интересную трансляционную модель для исследования легких.

Для второй количественной оценки мы сравнили распределение HTII между образцом легких взрослого и младенца. Пневмоциты 2 типа играют жизненно важную роль в структуре дистального эпителия легких. Эта уникальная способность ТИИ способствует восстановлению и регенерации альвеолярного эпителия32. В здоровых легких взрослого человека ТИИ составляют примерно 15% от общей клеточной популяции, в то время как их охват альвеолярной поверхности оценивается примерно в 5%33. HTII-280 является широко признанным легоспецифическим маркером для изучения развития и ответа клеток альвеолярного эпителия на повреждение, и он специфически локализуется в апикальных плазматических мембранах ТИИ. В эксперименте взрослая ткань была получена от пациента-донора, который умер из-за внутримозгового кровоизлияния и имел сопутствующее повреждение легких, в то время как младенческий образец был получен от смерти, связанной с асфиксией. Наши результаты показывают, что экспрессия HTII-280 была значительно ниже в образце легких взрослого человека, чем в образце младенца. Интересно, что, хотя HTII-280 экспрессируется в большинстве HTII, на его экспрессию также может влиять качество ткани, и она значительно снижена в поврежденной легочной ткани человека34. В старых легочных тканях наблюдается значительное снижение количества и секреторной активности ТИИ по сравнению с молодыми тканями, а у пожилых людей наблюдается значительно более низкая пролиферация, секреция и антиапоптотическая активность ТИИ по сравнению с молодыми тканями35. В соответствии с этим, идентификация и обнаружение белка клеточной поверхности, специфичного для ТИИ человека, может помочь в оценке тяжести повреждения легких и оценке подходов к лечению, направленных на улучшение восстановления легких36,37. Таким образом, используя этот конвейер, было бы очень интересно проводить альвеолярные исследования TII в более крупных когортах здоровья и болезней людей.

В заключение, этот протокол представляет собой более быстрый и простой подход к разрезанию легочной ткани. Этот метод предоставляет подробные инструкции по препарированию, разрезанию и окрашиванию легочной ткани, обеспечивая сохранение неповрежденной структуры легочной ткани. Он оптимизирует модель для изучения как здоровой, так и больной архитектуры легких, что приводит к повышению эффективности эксперимента. В целом, это исследование представляет многообещающий подход к изучению сложной пространственной биологии в патофизиологии легочной ткани у разных видов, что может помочь лучше понять молекулярные механизмы, участвующие в заболевании и репарации.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы выражают признательность за финансирование, полученное от Фонда молекулярной медицины Валленберга и Центра стволовых клеток Лундского университета, а также Центр биовизуализации Лундского университета (LBIC) за доступ к Nikon A1RHD.

Materials

24 well tissue culture inserts SARSTEDT 83.3932.300
4% paraformaldehyde SOLVECO 6095714
4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher scientific D1306
50 mL Falcon tube  SARSTEDT 2045221
Cluster of differentiation 31 (CD31) Abcam ab28364
Confocal microscope  Nikon A1R HD25
Elastin Abcam ab23747
Epredia X1000 Coverslip Thermo Fisher scientific 10318963
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides Thermo Fisher scientific 10149870
Forceps AESCULAP FB395R
Goat anti-mouse 647  Invitrogen  A21235
Goat anti-rabbit 568 Invitrogen  A11011
Human type II cells Terrace Biotech TB-27AHT2-280 
Invitrogen Fluoromount-G Mounting Medium Thermo Fisher scientific E41473
Low gelling temperature Agarose Sigma-Aldrich 1003467046
Lycopersicon Esculentum lectin Thermo Fisher scientific 2531965
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher scientific 50-100-8798
Plastic cup kontorsgiganten 885221
Scissors STILLE 101-8380-18
Smooth muscle actin Abcam ab5694
Sodium azide Sigma-Aldrich K54329188239
Super glue LOCTITE 2721643
Vibrating microtome Leica VT1200S
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
  2. Kawasaki, H., et al. The NanoSuit method: a novel histological approach for examining paraffin sections in a nondestructive manner by correlative light and electron microscopy. Laboratory Investigation. 100 (1), 161-173 (2020).
  3. Silva, I., et al. A Semi-quantitative scoring system for green histopathological evaluation of large animal models of acute lung injury. BIO-PROTOCOL. 12 (16), e4493 (2022).
  4. Kim, J. H., et al. Optimizing tissue-clearing conditions based on analysis of the critical factors affecting tissue-clearing procedures. Scientific Reports. 8 (1), 12815 (2018).
  5. Jain, D., et al. Immunocytochemistry for predictive biomarker testing in lung cancer cytology. Cancer Cytopathology. 127 (5), 325-339 (2019).
  6. Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: a literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2015).
  7. Morrison, L. E., Lefever, M. R., Lewis, H. N., Kapadia, M. J., Bauer, D. R. Conventional histological and cytological staining with simultaneous immunohistochemistry enabled by invisible chromogens. Laboratory Investigation. 102 (5), 545-553 (2022).
  8. Dineshshankar, J., et al. Kerosene as an alternative to xylene in histopathological tissue processing and staining: An experimental study. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11 (6), 376 (2019).
  9. Abdelaal, H. M., et al. Comparison of vibratome and compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biological Procedures Online. 17 (1), 2 (2015).
  10. Siwczak, F., Hiller, C., Pfannkuche, H., Schneider, M. R. Culture of vibrating microtome tissue slices as a 3D model in biomedical research. Journal of Biological Engineering. 17 (1), 36 (2023).
  11. Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Glymphatic pathways in the gyrencephalic brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 41 (9), 2264-2279 (2021).
  12. Bèchet, N. B., Kylkilahti, T. M., Mattsson, B., Petrasova, M., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Light sheet fluorescence microscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
  13. Bai, Y., Ai, X. Utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle. Journal of Visualized Experiments. (183), (2022).
  14. Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
  15. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  16. Lam, M., Lamanna, E., Organ, L., Donovan, C., Bourke, J. E. Perspectives on precision cut lung slices—powerful tools for investigation of mechanisms and therapeutic targets in lung diseases. Frontiers in Pharmacology. 14, 1162889 (2023).
  17. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
  18. Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of β 2- adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
  19. Ochoa, L. F., et al. Imaging of murine whole lung fibrosis by large scale 3D microscopy aided by tissue optical clearing. Scientific Reports. 8 (1), 13348 (2018).
  20. Tehrani, K. F., Park, J., Chaney, E. J., Tu, H., Boppart, S. A. Nonlinear imaging histopathology: a pipeline to correlate gold-standard hematoxylin and eosin staining with modern nonlinear microscopy. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 29 (4), (2023).
  21. Branchfield, K., et al. A three-dimensional study of alveologenesis in mouse lung. Developmental Biology. 409 (2), 429-441 (2016).
  22. Li, Y., et al. Precision vibratome for high-speed ultrathin biotissue cutting and organ-wide imaging. iScience. 24 (9), 103016 (2021).
  23. Qian, G., et al. DOCK2 promotes pleural fibrosis by modulating mesothelial to mesenchymal transition. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 66 (2), 171-182 (2022).
  24. Cagle, P. T., Allen, T. C. Pathology of the pleura: What the pulmonologists need to know. Respirology. 16 (3), 430-438 (2011).
  25. Jantz, M. A., Antony, V. B. Pleural fibrosis. Clinics in Chest Medicine. 27 (2), 181-191 (2006).
  26. Viana, F., O’Kane, C. M., Schroeder, G. N. Precision-cut lung slices: A powerful ex vivo model to investigate respiratory infectious diseases. Molecular Microbiology. 117 (3), 578-588 (2022).
  27. Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices. Journal of Visualized Experiments. (83), e50970 (2014).
  28. Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (122), e55465 (2017).
  29. Klouda, T., Kim, H., Kim, J., Visner, G., Yuan, K. Precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies. Journal of Visualized Experiments. (171), e62392 (2021).
  30. Ghaidan, H., et al. Reduction of primary graft dysfunction using cytokine adsorption during organ preservation and after lung transplantation. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
  31. Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (1985).
  32. Ruaro, B., et al. The history and mystery of alveolar epithelial type II cells: focus on their physiologic and pathologic role in lung. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2566 (2021).
  33. Crapo, J. D., Barry, B. E., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. The American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
  34. Evans, K. V., Lee, J. -. H. Alveolar wars: The rise of in vitro models to understand human lung alveolar maintenance, regeneration, and disease. Stem Cells Translational Medicine. 9 (8), 867-881 (2020).
  35. Chen, J. -. X., et al. Sirtuin 3 ameliorates lung senescence and improves type II alveolar epithelial cell function by enhancing the FoxO3a-dependent antioxidant defense mechanism. Stem Cells and Development. 30 (17), 843-855 (2021).
  36. Zacharias, W. J., et al. Regeneration of the lung alveolus by an evolutionarily conserved epithelial progenitor. Nature. 555 (7695), 251-255 (2018).
  37. Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).

Tags

Vibratome SectioningAgarose EmbeddingMultiplex Fluorescence ImagingLarge Animal ModelsSpatial BiologyImmunofluorescenceLight Sheet Fluorescence MicroscopyLung Transplant RejectionSpatial Protein Expression

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wang, Q., Bechet, N. B., Lindstedt, S. Automated Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (200), e65943, doi:10.3791/65943 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image