マルチプレックス蛍光イメージングのためのアガロース包埋肺組織の自動ビブラトーム切片化

肺組織切片を生成するプロセスには、準備、包埋、切片化など、いくつかの重要なステップが含まれます。アガロース溶液(3%(w/v))は、1.5gの低融点アガロースを50mLの滅菌PBSに溶解して作られます。必要な消耗品は、プラスチックカップ、50 mLのコニカルチューブの蓋(縁を取り外した状態)、鉗子、はさみです。肺組織は、細かい鉗子と滅菌ハサミで慎重に小さなブロックに切除されます(図1A、B)。次に、肺組織ブロックを埋め込むために、カップの底に少量のアガロースを充填し、アガロースの表面に蓋をして、カップを4°Cで5分間保存します(図1C)。約1mLの液体アガロースを蓋に加え、肺組織ブロックを蓋の上に置きます。アガロースを2〜3分間放置し、室温で半固化させます(図1D)。肺ブロックが半固化アガロースによって所定の位置に保持されると、肺組織ブロックが完全に沈むまで液体アガロースがカップに注がれます。これを4°Cで15分間保存します(図1E、F)。低融点アガロース包埋は、肺組織に必要なサポートと剛性を提供し、スライスプロセス中に元の構造を維持するのに役立ちます。鋭利な刃を使用して、肺組織を取り巻く過剰なアガロースを除去します。組織の周囲に約5mmの厚さの均一な層が残されています(図1G)。次に、切除した肺組織ブロックを組織ホルダーに慎重に接着します(図1H)。ビブラトームバッファートレイにPBSを充填し、周囲のアイスバスに氷を入れ、バッファートレイに検体ディスクを取り付けます(図1I)。パネルに設定されたビブラトーム切断パラメータは、スライスの厚さ:200μm;周波数:100 Hz;ブレードの振幅:1.3mm;ブレードの前進速度:0.02〜0.03 mm / s、これは組織の剛性に依存します(図1J)。最後に、自由浮遊スライスで染色を行います(図1K-M)。 平滑筋アクチン(SMA、平滑筋細胞および筋線維芽細胞マーカー)、エラスチン(細胞外マトリックスタンパク質)、および気管支肺胞上皮細胞に結合するLycopersicon Esculentum lectin(LEA)について、各種から200 μmの切片で免疫蛍光染色を行いました。肺は構造的に不均一な組織であるため、マウス、ブタ、ヒトの肺胞管、血管、肺内細気管支、肺胞などの構造全体でSMAとエラスチンの分布の違いが観察されます(図2A-L)。20μmの体積の細気管支を高解像度でレンダリングすると、肺内の微細構造を半3次元レベルで調べることができることがわかります(補足ビデオS1)。定量的な例として、画像トレーシングを利用して、サンプル(n = 20肺胞)間で肺胞のサイズがどのように異なるかを示します(図2L、M)。 これらの高度なイメージングデータを定量的に利用する方法を示すために、成人と乳児のヒト肺組織における2型肺細胞(TII)細胞分布を比較しました。ヒト特異的な2型肺胞細胞抗体であるHTII-280は、ヒト2型細胞の表面に強い親和性を示します(図3A-F)。これらの細胞は、さらに、体積イメージングを用いて単一の肺胞の3次元空間で観察することができる(補足ビデオS2)。成人と乳児のサンプル間のTII数を定量化するために、10のランダムな視野(fov)でHTII-280カウントを処理しました。これらのサンプル間で、乳児サンプルは有意に高いTII細胞数をもたらしました(図3G)。しかし、乳児サンプルは成人よりも有意に高い足場被覆率を示しており、細胞数が多いことを説明できる可能性があります(図3H)。これを説明するために、次に、足場の被覆率に基づいて、組織のmm2あたりの細胞数としてTIIの数を評価しましたが、乳児サンプルでは有意に高いTII数を維持していました(図3I)。したがって、乳児サンプルのTII数が多いのは、足場の被覆率の増加によるものではなく、全体的なFOVではなく、足場の面積に基づいて肺の細胞分布を評価することの重要性を強調しています。 図1: 肺ティッシュの切片を切るためのプロトコル。 (A)溶液および材料:1.5gの低融点アガロースを50mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水に溶解して得られる3%(w / v)アガロース溶液。プラスチックカップ;50mLのコニカルチューブの蓋。鉗子、ハサミ。(B)肺組織を細かい鉗子と滅菌ハサミを用いて解剖した。(C)カップの底に少量のアガロースを入れ、アガロースの表面に蓋をします。次に、4°Cで5分間保管します。 (D)1〜2 mLの液体アガロースを蓋にゆっくりと加え、肺組織の塊を蓋に注意深く置き、4°Cで2分間保管します。 (E、F)肺組織の塊が完全に沈むまで液体アガロースをカップに注ぎ、4°Cで15分間保管します。 次に、プラスチックカップをそっと壊します。(G)鋭利な刃を使用して、肺組織を囲む余分なアガロースを除去し、組織の周囲に約5mmの厚さの均一な層を残します。(H)切除された肺組織ブロックは、組織ホルダーに慎重に接着されます。(I)ビブラトームバッファートレイにPBSを充填し、周囲のアイスバスに氷を入れ、検体ディスクをバッファートレイに取り付けます。(J)ビブラトームのパネルで切断パラメータを設定します。スライスの厚さ:200 μm、周波数:100 Hz、ナイフの振幅:1.3 mm、ブレードの前進速度は0.02-0.04 mm / sです。 (K-M) アガロースに埋め込まれたままで、免疫蛍光染色の準備ができている自由浮遊スライスの代表的な画像。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図2:ヒト、ブタ、マウスの肺構造の免疫蛍光画像。 (A-L)マウス、ブタ、ヒトの肺組織切片における肺胞管、血管、細気管支、肺胞の代表的な画像。SMA(緑色で表示)は平滑筋細胞のマーカーであり、肺組織の血管壁と気管支壁に観察されます。エラスチン(赤で表示)は、肺の細胞外マトリックスの一部を形成します。(M)ヒト、ブタ、マウスの両方のサンプルについて、各肺組織スライスのランダムな位置を20個選択することによる肺胞サイズの定量化。ヒストグラムは、各グループ内の歯槽の大きさの分布を示すために利用されました。スケールバー = 50 μm (A-F, H-L), 100 μm (G).Kruskall-Wallis 検定 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.略語:DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;LEA = Lycopersicon Esculentum レクチン;SMA = 平滑筋アクチン;ms = マウス;hmn = 人間。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図 3.ヒト成人および乳児サンプルにおける2型肺細胞分布。(A,B)HTII-280(赤色)、CD31(緑色)、LEA(灰色)で染色した成人および乳児のヒト肺組織の代表的な画像。(C、D) 2型肺細胞の分布のみを示す成人および乳児の代表的な画像。(E、F)成人および乳児のヒト肺サンプルから採取した個々の2型肺細胞の単一細胞分解能の代表的な画像。(G)成人と乳児のサンプル間の2型肺細胞数の定量化。(H)成人および乳児サンプルにおける肺組織足場面積の被覆率(%対空気)の定量化。(I)成人および乳児サンプル中の組織mm2あたりの2型肺細胞の定量。スケールバー = 5 μm (E,F)、100 μm (A-D)。n = 10 FOV/サンプル。対応のないt検定またはMann-Whitney検定。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。略語:DAPI = 4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;LEA = Lycopersicon Esculentum レクチン;HTII = ヒトII型細胞;CD31 = 血小板内皮細胞接着分子-1/分化クラスター31;FOV = 視野角。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 補足動画 S1: DAPI、LEA、SMA、およびエラスチンを使用して染色した単一のブタ気道の20 μmイメージングボリュームのビデオは、気道壁要素の構造の高解像度ビューを示しています。略語:DAPI = 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;LEA = Lycopersicon Esculentum レクチン;SMA = 平滑筋アクチン。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足動画 S2: DAPI、LEA、およびHTII-280を使用して染色した単一肺胞の30 μmイメージングボリュームのビデオで、構造全体にわたる2型肺細胞の分布を示しています。略語:DAPI = 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;LEA = Lycopersicon Esculentum レクチン;SMA = 平滑筋アクチン。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。