פיתחנו טכניקת עיבוד רקמות המשתמשת ברקמת ריאה משובצת ויברטומה ואגרוז ליצירת קטעי ריאה, ובכך אפשרנו רכישה של תמונות ברזולוציה גבוהה של ארכיטקטורת ריאות. השתמשנו בצביעת אימונופלואורסנציה כדי לצפות בביטוי חלבונים מרחבי באמצעות סמנים מבניים ספציפיים של הריאה.
בשל השבריריות המבנית הטבועה בה, הריאה נחשבת לאחת הרקמות הקשות יותר לעיבוד עבור קריאות מיקרוסקופיות. כדי להוסיף תמיכה מבנית לחתך, חתיכות של רקמת ריאה מוטמעות בדרך כלל בתרכובת פרפין או OCT ונחתכות עם מיקרוטום או קריוסטט, בהתאמה. טכניקה עדכנית יותר, המכונה פרוסות ריאה חתוכות במדויק, מוסיפה תמיכה מבנית לרקמת ריאה טרייה באמצעות חדירת אגרוז ומספקת פלטפורמה לשמירה על רקמת הריאה הראשונית בתרבית. עם זאת, בשל מיסוך אפיטופים ועיוות רקמות, אף אחת מהטכניקות הללו אינה מתאימה לפיתוח קריאות הדמיית אור מתקדמות הניתנות לשחזור, שיהיו תואמות בין נוגדנים ומינים מרובים.
לשם כך, פיתחנו צנרת לעיבוד רקמות, המשתמשת בהטבעה אגרוזית של רקמת ריאה קבועה, יחד עם חתך ויברטומי אוטומטי. זה הקל על יצירת קטעי ריאה בעובי של 200 מיקרומטר עד 70 מיקרומטר, בריאות עכבר, חזיר ואדם, שאינם דורשים שליפת אנטיגן, ומייצגים את הגרסה הכי פחות “מעובדת” של הרקמה המבודדת המקומית. באמצעות פרוסות אלה, אנו חושפים קריאת הדמיה מרובת משתתפים המסוגלת להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה שניתן להשתמש בביטוי החלבונים המרחבי שלהן כדי לכמת ולהבין טוב יותר את המנגנונים העומדים בבסיס פגיעה והתחדשות ריאתית.
פרוסות רקמת ריאה Ex vivo נמצאות בשימוש נרחב במחקר של מחלת ריאות1. תקני הזהב הנוכחיים, במיוחד במחקרים קליניים ותרגומיים בבעלי חיים גדולים, משתמשים בהמטוקסילין ובצביעת אאוזין בשילוב עם מיקרוסקופ ברייטפילד וניקוד מבוסס צופה כדי להעריך ולדרג תפקוד ריאות 2,3. למרות שהיא עדיין טכניקה בעלת ערך, היא מציגה מגבלות במונחים של רזולוציה מרחבית ומספר הסמנים שניתן לצלם בו זמנית. יתר על כן, רקמת הריאה נדרשת לעבור שטיפות נרחבות על בסיס ממס, מה שגורם להתייבשות, התכווצות והתייבשות מחדש של הרקמה לפני ההדמיה הסופיתשלה 4. תהליך זה לא רק גוזל זמן אלא גם אינו ידידותי לסביבה, מסווה אפיטופים של חלבונים, ועלול לעורר שינויים מבנייםברקמה 5,6,7,8. עם זאת, עבור רקמת ריאה, הטבעה בפרפין לפני חתך היה הכרח בשל השבריריות המבנית של הריאה. לעומת זאת, איברים מוצקים כמו המוח ניתנים לחיתוך באמצעות מיקרוטום רוטט (ויברטום), הן ברקמה קבועה והן ברקמה טרייה 9,10,11,12.
כדי לאפשר חתך ויברטומי ברקמת ריאה, נקבעה שיטה המכונה פרוסות ריאה חתוכות בדיוק (PCLS) שבה נקודת התכה נמוכה מוזרקת לרקמת ריאה טרייה דרך דרכי הנשימה או כלי הדם ומשאירה להתמצק13,14. האגרוז בדרכי הנשימה מספק תמיכה מבנית מספקת כדי לאפשר חתך ויברטומי 9,14. במכרסמים, זה פשוט להשגה כמו agarose ניתן להזריק דרך קנה הנשימה; עם זאת, ברקמת חזיר ואדם, זה יכול להיות מאתגר לאתר נתיב אוויר / כלי מתאים בתוך ביופסיה נתונה15,16. יתר על כן, גם אם נמצא נתיב אוויר/כלי שיט כזה, נדרש בדרך כלל כוח משמעותי כדי להזריק את האגרוז, מה שעשוי להשפיע על מורפולוגיית הריאה הבאה17.
כדי להתגבר על האתגרים המנוסים בהטבעה / חתך / צביעה של פרפין וזרימת העבודה של PCLS, הקמנו צינור עיבוד חדש לרקמת ריאה קבועה. תהליך עבודה זה מאפשר שימוש בויברטום לחיתוך, יכול לייצר פרוסות דקות יותר מאשר ב- PCLS, ומניב פרוסות שאינן דורשות שליפת אנטיגן להדמיית פלואורסצנטיות מרובה. שיטה זו מציעה אמצעי של “עיבוד מינימלי” ליצירת קטעי ריאות שניתן להשתמש בהם במיקרוסקופ אור מתקדם. יתר על כן, ניתן להשתמש בקריאות הדמיה כדי להדגים את היחסים המרחביים של תאים ומבנים אנטומיים בתוך רקמת הריאה על ידי לכידת הארכיטקטורה הנפחית של הרקמה 18,19,20,21. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול ליצירת מקטעי ריאה אלה ומדגים כתמים מרובים המיושמים על כל אחת מהרקמות הללו וכיצד ניתן להשתמש בנתוני הדמיה מתקדמים אלה לצורך כימות.
בפרוטוקול זה אנו מציגים שיטה משופרת מבוססת ויברטומים ליצירת קטעי ריאה. בהשוואה לטכניקות עיבוד מבוססות פרפין, שיטה זו חסכונית יותר, חסכונית יותר בזמן וטובה יותר לסביבה22. יתר על כן, שיטה זו מסייעת לשמור על שלמות המבנה של פרוסות רקמת הריאה ומאפשרת הדמיה אימונופלואורסצנטית מתקדמת ללא צורך בשליפת אנטיגן. עם זאת, במהלך הניסויים שלנו, מצאנו גם מגבלות מסוימות לזרימת העבודה הזו. ריאות חולות יכולות להפריע לתהליך החיתוך עקב הרס רקמות הנגרם על ידי שינויים פתולוגיים. בעת שימוש בויברטומה לחיתוך, חסימות דרכי הנשימה ורקמת ריאה פיברוטית חמורה יכולות לעכב את הלהב, מה שהופך את תהליך חיתוך רקמות אלה למאתגר יותר. עם זאת, ניתן להתגבר על כך על ידי הפחתת מהירות הלהב ותמיכה ברקמה עם מברשת צבע עדינה. אתגרים דומים נובעים מהתעבות הצדר, שהיא תוצאה שכיחה בדלקת ריאות, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) ופיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF)23,24,25. אם הצדר אינו מעניין לניסוי, אנו ממליצים להסיר אותו לפני החתך או על ידי בידוד נפח ריאה הרחק מהצדר. אם הצדר נחוץ, ניתן לחתוך אותו באמצעות מניפולציה דומה לזו שלעיל, הכוללת מהירויות להב איטיות יותר ותמיכה בפרוסה ממברשת עדינה.
בעוד פרוסות ריאה חתוכות במדויק יכולות לשמר את הארכיטקטורה התלת-ממדית והסביבה הטבעית של הריאה26, חשוב לציין כי יצירת PCLS היא תהליך מורכב וגוזל זמן. ההצלחה של יצירת פרוסות רקמת הריאה תלויה מאוד ביעילות של מילוי agarose, אשר, בתורו, מושפע על ידי נוכחות של צדר שלם אתרי הזרקה קיימא ברקמה המתקבלת. זה פשוט להשגה במכרסמים כמו agarose יכול בקלות להיות מוכנס דרך קנה הנשימה לתוך ריאות שלמות27,28,29. עם זאת, במחקר בבעלי חיים גדולים, ביופסיות שנלקחות בניסוי הן בדרך כלל ממקטעי ריאות דיסטליים, אשר חסרים נתיב אוויר גדול מספיק כדי לקנן30,31. לכן, במקום להזריק אגרוז לסימפונות או לכלי הדם, אנו מאמצים שיטה זו שבה רקמת הריאה, ללא קשר למין המקור או נפח הדגימה, מוטמעת באגרוז בנקודת התכה נמוכה כדי ליצור פרוסות רקמת ריאה. גישה זו קלה יותר מבחינה טכנית ומטרתה למזער את הנזק לרקמות ככל האפשר. בהתבסס על הניסיון שלנו, שיטה זו הוכיחה יעילות גבוהה יותר וקלות ביצירת קטעי רקמת ריאה. הוא משמר ביעילות את המורפולוגיה של הנאדיות ומתאים במיוחד לחיתוך רקמת ריאה, ומאפשר יצירת הדמיה פלואורסצנטית רב-תכליתית ברזולוציה גבוהה הניתנת לחזרה.
במחקר זה, אנו מדגימים גם שני כימות מבוסס מדגם עבור נתוני ההדמיה שנוצרו. הראשון השתמש במעקב אחר תמונות כדי להעריך הבדלים בגודל הנאדיות בין דגימות מינים. באופן לא מפתיע, נאדיות עכברים היו הקטנות ביותר, בעוד נאדיות חזיר ונאדיות אנושיות היו דומות בגודלן, מה שהדגיש חזירים כמודל תרגום מעניין לחקר ריאות.
לצורך הכימות השני, השווינו את התפלגות HTII בין דגימת ריאות של מבוגרים לתינוקות. פנאומוציטים מסוג 2 ממלאים תפקיד חיוני במבנה אפיתל הריאה הדיסטלי. יכולת ייחודית זו של TIIs תורמת לתיקון והתחדשות של אפיתל מכתשית32. בריאה האנושית הבוגרת והבריאה, TIIs מהווים כ-15% מכלל אוכלוסיית התאים, בעוד שהכיסוי שלהם של שטח הפנים של הנאדיות מוערך בכ-5%33. HTII-280 הוא סמן ספציפי לריאות מוכר לחקר ההתפתחות והתגובה של תאי אפיתל בנאדיות לפציעה, והוא ממוקם באופן ספציפי לקרומי הפלזמה האפיקליים של TIIs. בניסוי התקבלה רקמה בוגרת מתורם שנפטר עקב דימום תוך-מוחי וסבל מפגיעה ריאתית במקביל, ואילו דגימת התינוק הגיעה מתמותה הקשורה לחנק. הממצאים שלנו מצביעים על כך שהביטוי של HTII-280 היה נמוך משמעותית בדגימת הריאה הבוגרת מאשר בדגימת התינוקות. מעניין לציין כי בעוד HTII-280 מתבטא ברוב HTIIs, הביטוי שלו יכול להיות מושפע גם מאיכות הרקמות, והוא מופחת באופן משמעותי ברקמת הריאה האנושית הפגועה34. רקמות ריאה מזדקנות מציגות ירידה משמעותית במספר ובפעילות ההפרשה של TII בהשוואה לרקמות צעירות, ואנשים מבוגרים מפגינים התפשטות, הפרשה ופעילות אנטי-אפופטוטית נמוכה משמעותית של TII בהשוואה לרקמות צעירות35. בהתאם לכך, זיהוי וזיהוי של חלבון פנים-תא ספציפי ל-TIIs אנושיים יכול לסייע בהערכת חומרת הפגיעה הריאה ובהערכת גישות טיפול שמטרתן לשפר את תיקון הריאות36,37. לכן, באמצעות צינור זה, יהיה זה עניין רב לערוך מחקרי TII בנאדיות בקבוצות אנושיות גדולות יותר של בריאות ומחלות.
לסיכום, פרוטוקול זה מציג גישה מהירה וקלה יותר לחיתוך רקמת ריאה. שיטה זו מספקת הוראות מפורטות להכנת רקמת הריאה, חיתוך וצביעה, ומבטיחה שמירה על מבנה רקמת הריאה השלם. הוא מייעל את המודל לחקר ארכיטקטורת ריאות בריאות וחולות כאחד, מה שמוביל לשיפור יעילות הניסוי. בסך הכל, מחקר זה מציג גישה מבטיחה לחקר ביולוגיה מרחבית מורכבת בפתופיזיולוגיה של רקמת ריאה בין מינים, אשר יכולה לסייע בהבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים הפועלים במחלות ובתיקון.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים בהכרת תודה על המימון שהתקבל מקרן וולנברג לרפואה מולקולרית וממרכז תאי גזע באוניברסיטת לונד ומודים למרכז ההדמיה הביולוגית של אוניברסיטת לונד (LBIC) על הגישה ל-Nikon A1RHD.
24 well tissue culture inserts | SARSTEDT | 83.3932.300 | |
4% paraformaldehyde | SOLVECO | 6095714 | |
4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher scientific | D1306 | |
50 mL Falcon tube | SARSTEDT | 2045221 | |
Cluster of differentiation 31 (CD31) | Abcam | ab28364 | |
Confocal microscope | Nikon | A1R HD25 | |
Elastin | Abcam | ab23747 | |
Epredia X1000 Coverslip | Thermo Fisher scientific | 10318963 | |
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher scientific | 10149870 | |
Forceps | AESCULAP | FB395R | |
Goat anti-mouse 647 | Invitrogen | A21235 | |
Goat anti-rabbit 568 | Invitrogen | A11011 | |
Human type II cells | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | |
Invitrogen Fluoromount-G Mounting Medium | Thermo Fisher scientific | E41473 | |
Low gelling temperature Agarose | Sigma-Aldrich | 1003467046 | |
Lycopersicon Esculentum lectin | Thermo Fisher scientific | 2531965 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher scientific | 50-100-8798 | |
Plastic cup | kontorsgiganten | 885221 | |
Scissors | STILLE | 101-8380-18 | |
Smooth muscle actin | Abcam | ab5694 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | K54329188239 | |
Super glue | LOCTITE | 2721643 | |
Vibrating microtome | Leica | VT1200S |