Visualización in vivo de la actividad espontánea en la corteza sensorial del ratón neonatal con una resolución de una sola neurona
Summary
Las áreas sensoriales primarias en el neocórtex exhiben actividades espontáneas únicas durante el desarrollo. Este artículo describe cómo visualizar las actividades neuronales individuales y las áreas sensoriales primarias para analizar las actividades sincrónicas específicas del área en ratones neonatos in vivo.
Abstract
El cerebro de los mamíferos experimenta cambios dinámicos en el desarrollo tanto a nivel celular como de circuitos a lo largo de los períodos prenatales y postnatales. Tras el descubrimiento de numerosos genes que contribuyen a estos cambios en el desarrollo, ahora se sabe que la actividad neuronal también modula sustancialmente estos procesos. En la corteza cerebral en desarrollo, las neuronas exhiben patrones de actividad sincronizados que se especializan en cada área sensorial primaria. Estos patrones difieren marcadamente de los observados en la corteza madura, enfatizando su papel en la regulación de los procesos de desarrollo específicos del área. Las deficiencias en la actividad neuronal durante el desarrollo pueden conducir a diversas enfermedades cerebrales. Estos hallazgos ponen de manifiesto la necesidad de examinar los mecanismos reguladores que subyacen a los patrones de actividad en el desarrollo neuronal. Este artículo resume una serie de protocolos para visualizar las áreas sensoriales primarias y la actividad neuronal en ratones neonatos, para obtener imágenes de la actividad de las neuronas individuales dentro de los subcampos corticales utilizando microscopía de dos fotones in vivo, y para analizar las correlaciones de actividad relacionadas con los subcampos. Mostramos resultados representativos de la actividad sincrónica tipo patchwork dentro de barriles individuales en la corteza somatosensorial. También discutimos varias aplicaciones potenciales y algunas limitaciones de este protocolo.
Introduction
La corteza cerebral contiene varias áreas sensoriales con distintas funciones. Las áreas reciben entradas que se originan en sus órganos sensoriales correspondientes, en su mayoría transmitidas a través de la médula espinal o el tronco encefálico y transmitidas a través del tálamo 1,2. En particular, las neuronas en cada área sensorial primaria exhiben una actividad sincronizada única durante las primeras etapas del desarrollo, que también se originan en los órganos sensoriales o en los centros nerviosos inferiores, pero esencialmente difieren de las actividades observadas en la cortezamadura.
En los roedores neonatos, por ejemplo, el área visual primaria (V1) muestra una actividad ondulatoria, que se origina en la retina (onda retiniana) y se propaga a través de toda la vía visual mientras conserva la retinotopía4. El área auditiva primaria (A1) exhibe actividad sincrónica organizada en subregiones en forma de banda que corresponden a las bandas de isofrecuencia en el cerebro maduro. La actividad emana de las células ciliadas internas de la cóclea 5,6. La corteza de barril en el área somatosensorial primaria (S1) muestra un patrón de actividad similar a un mosaico en el que las neuronas de la capa 4 dentro de barriles individuales, es decir, las neuronas que responden a los bigotes individuales, se activan sincrónicamente7. Aunque se ha propuesto su origen en el ganglio del trigémino, la fuente de la actividad sigue siendo desconocida7. En consecuencia, los patrones de actividad neonatal están especializados tanto dentro de cada área sensorial primaria como dentro de los subcampos intraaéreos. La visualización simultánea de la actividad neuronal y la estructura de las áreas sensoriales primarias puede facilitar una investigación sobre la contribución de estos patrones de actividad al desarrollo de los sistemas sensoriales.
En este artículo, resumimos una serie de protocolos: (1) para visualizar las actividades neuronales individuales utilizando el marcaje disperso de GCaMP y áreas sensoriales primarias utilizando ratones TCA-RFP que expresan la proteína fluorescente roja en los axones talamocorticales7, (2) para obtener imágenes de la actividad a nivel de una sola célula en ratones neonatos utilizando microscopía de dos fotones in vivoy (3) analizar las correlaciones de actividad dentro de la corteza de barril S1. Los resultados representativos muestran una actividad sincronizada similar a un mosaico dentro de barriles individuales de un ratón (P)6 del día postnatal. A pesar de algunas limitaciones, esta técnica se puede utilizar para la obtención de imágenes crónicas, la obtención de imágenes de campo amplio en múltiples áreas sensoriales y diversos experimentos de manipulación. El análisis multifacético de la actividad neuronal durante el desarrollo enriquecerá nuestra comprensión de los mecanismos de formación de circuitos cerebrales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dado que las actividades espontáneas emergen del órgano sensorial o del sistema nervioso inferior y viajan al área sensorial primaria a través de una vía equivalente a la deun sistema nervioso maduro, es crucial definir el área sensorial primaria y la ubicación de las neuronas fotografiadas dentro del área. En este protocolo, abordamos este requisito mediante el empleo de ratones transgénicos que visualizan los axones talamocorticales y el sistema Superno…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia Grants-in-Aid for Transformative Research Areas (B) (22H05092, 22H05094) y para las Becas de Investigación Científica 20K06876, AMED bajo el número de subvención 21wm0525015, la Fundación Takeda Science, la Fundación Naito, la Fundación Kato Memorial Bioscience, la Fundación Kowa Life Science, NIG-JOINT (24A2021) (a H.M.); y la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (SIMCh) 19K06887 y 22K06446, el Fondo Conmemorativo Kodama para la Investigación Médica, la Fundación Conmemorativa Uehara, la Fundación Conmemorativa Kato Memorial Bioscience Foundation y la Fundación Científica Takeda (a N.N-T.). Agradecemos al Dr. Takuji Iwasato por los ratones TCA-RFP.
Materials
| 20× objective lens (water immersion) | |||
| 250 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System | Corning | 431096 | |
| 4%-paraformaldehyde phosphate buffer solution (4% PFA) | Nacalai | 09154-85 | |
| Acrylic resin (UNIFAST II) | GC | N/A | |
| Agarose | Sigma | A9793 | |
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | |
| CaCl2•2H2O | Nacalai | 06731-05 | |
| Electroporator | BEX | GEB14 | |
| Eye drop (Scopisol) | Senju Pharmaceutical | N/A | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M165FC | |
| Glucose | Nacalai | 16806-25 | |
| Heating pad | Muromachi Kikai | FHC-HPS | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Isoflurane | Pfizer | N/A | |
| KCl | Nacalai | 28514-75 | |
| MgSO4•7H2O | Wako | 131-00405 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-100 | |
| Multiphoton laser | Spectra-Physics | Mai Tai eHP DeepSee | |
| Multiphoton microscope | Zeiss | LSM 7MP | |
| NaCl | Nacalai | 31320-05 | |
| Non-woven fabric (Kimwipe) | Kimberly Clark | S-200 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Nacalai | 27575-31 | |
| Plasmid: CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE | Addgene | pK175 | |
| Plasmid: TRE-nCre | Addgene | pK031 | |
| Precision calibrated micropipets | Drummond | 2-000-050 | |
| Razor blade | Feather | FA-10 | |
| Rimadyl (50 mg/mL Carprofen) | Zoetis JP | N/A | |
| Round cover glass, 3-mm-diameter | Matsunami | CS01078 | |
| Saline | Otsuka | 035175315 | |
| Sodium pentobarbital | Nacalai | 26427-72 | |
| Stage for imaging living pup (two single-axis translation stage for XY positioning, two-axis goniometer, base plate, adjustable pillar for z positioning) | ThorLabs | LT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M | |
| TCA-RFP mouse | N/A | N/A | Mizuno et al., 2018a |
| Tissue adhesive (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Titanium bar | Endo Scientific Instrument | N/A | Custom made (Mizuno et al., 2018b) |
| Titanium bar fixing plate | N/A | Custom made (Mizuno et al., 2018b) | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tweezers with platinum plate electrode, 5 mm diameter | BEX | CUY650P5 | |
| Wild-type ICR mouse | Nihon SLC | Slc:ICR |
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