İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu
Summary
Bu protokol, yetişkin fare omuriliğinden saflaştırılmış astrositlerin ve mikrogliaların izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir ve RNA analizi ve hücre kültürü gibi sonraki uygulamaları kolaylaştırır. İzole edilmiş hücrelerin hem kalitesini hem de verimini artırmak için tasarlanmış ayrıntılı hücre ayrışma yöntemlerini ve prosedürlerini içerir.
Abstract
Astrositler ve mikroglia, merkezi sinir sistemi gelişiminde, yaralanma yanıtlarında ve nörodejeneratif hastalıklarda çok önemli roller oynar. Bu son derece dinamik hücreler, çevresel değişikliklere hızlı tepkiler sergiler ve morfoloji, transkripsiyonel profiller ve işlevler açısından önemli heterojenlik gösterir. Glial hücrelerin sağlık ve hastalıktaki işlevlerine ilişkin anlayışımız önemli ölçüde ilerlemiş olsa da, farklı hücre popülasyonlarını kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için hakaret veya yaralanmalar bağlamında yürütülen in vitro, hücreye özgü analizlere ihtiyaç duyulmaktadır. Yetişkin fareden hücrelerin izole edilmesi, hücrelerin patolojik koşullar altında ve belirli zaman noktalarında analizine izin verdiği için hücre hatlarına veya yenidoğan hayvanlara göre çeşitli avantajlar sunar. Ayrıca, beyin tutulumu hariç omuriliğe özgü izolasyona odaklanmak, deneysel otoimmün ensefalomiyelit, omurilik yaralanması ve amyotrofik lateral skleroz dahil olmak üzere omurilik patolojilerinin araştırılmasını sağlar. Bu protokol, yetişkin fare omuriliğinden astrositleri ve mikrogliaları izole etmek için etkili bir yöntem sunarak, fonksiyonel, moleküler veya proteomik aşağı akış çalışmalarında potansiyel uygulamalarla acil veya gelecekteki analizleri kolaylaştırır.
Introduction
Astrositler ve mikroglia, merkezi sinir sisteminde (MSS) hayati roller oynayan, nöronal fonksiyonu düzenlemek, CNS gelişimine katkıda bulunmak, kan-beyin bariyerini korumak ve diğer kritik süreçlere katılmak gibi sorumlulukları kapsayan çok yönlü glial hücrelerdir 1,2,3,4 . Homeostazın korunmasındaki rollerinin yanı sıra, bu glial hücreler ayrıca yaralanma ve onarım mekanizmalarında da önemli bir rol oynar. Mikroglia, hakaret veya yaralanmaları takiben fagositik, inflamatuar ve göç etme yetenekleriyle bilinir 5,6,7. Hastalıktaki astrosit yanıtları eşit derecede çeşitlidir, iltihaplanmaya, glial skarların oluşumuna ve kan-beyin bariyerinin tehlikeye atılmasınakatkıları kapsar 8,9. CNS’deki mikroglia ve astrositlerin zararlı ve onarıcı rolleri hakkındaki anlayışımız artmış olsa da, hem yapılarında hem de işlevlerinde doğal heterojenlik, onları çeşitli bağlamlarda incelemek için sağlam araçlar gerektirmektedir.
Mikroglia ve astrositlerin sağlık ve hastalıktaki rolleri hakkında daha fazla bilgi edinmek, in vivo ve in vitro araştırmaların birleşik bir yaklaşımını gerektirir. İn vivo teknikler, CNS içindeki glial hücreler ve nöronlar arasındaki karmaşık karışmadan yararlanırken, in vitro metodolojiler, tek hücreli fonksiyonları veya spesifik uyaranlar altındaki yanıtları değerlendirirken değerli olduğunu kanıtlamaktadır. Her yöntem benzersiz avantajlar sunar; İn vitro çalışmalar, komşu hücrelerden doğrudan veya dolaylı girdi olmadan bu hücre tiplerinin spesifik rollerini anlamak için gereklidir. Ek olarak, ölümsüz hücre hatlarını kullanan in vitro tahliller, süresiz olarak çoğalma yeteneği, maliyet verimliliği ve bakım kolaylığı dahil olmak üzere belirli faydalar sunar. Bununla birlikte, birincil hücrelerin, hücre hatlarına kıyasla normal fizyolojik tepkileri daha yakından taklit ettiğine dikkat etmek önemlidir. Bu fizyolojik alaka, fonksiyonel testlerde ve transkriptomik analizlerde çok önemlidir.
Özellikle yetişkin fare omuriliğinden birincil hücrelerin elde edilmesindeki zorluklardan biri, örneklerin miktarı ve canlılığında yatmaktadır. Beyinden daha küçük olan ve önemli miktarda miyelin içeren yetişkin omuriliği, benzersiz zorluklar doğurur. Yenidoğan hayvanlardan veya yetişkin fare beyninden saf, canlı glial hücrelerin izolasyonunu detaylandıran birkaç yayınlanmış protokol olsa da 10,11,12,13, bu metodolojiler omuriliğe özgü hastalıkları ve yaralanmaları incelemek için uygun olmayabilir. Bu protokolde, yetişkin fare omuriliğinden saf, canlı mikroglia ve astrositleri verimli bir şekilde izole etmek için kapsamlı bir prosedür sunuyoruz, hücre kültürü ve transkriptomik analizlerde aşağı akış uygulamalarını kolaylaştırıyoruz. Bu protokol, bu hücreleri 10 haftadan 5 aya kadar olan yetişkin farelerden izole etmek için başarıyla kullanılmış ve koşullu nakavt fareleri, ilaç tepkileri, gelişimsel araştırmalar ve yaşa bağlı modelleri içeren çalışmalar dahil olmak üzere çeşitli bağlamlarda faydasını göstermiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Saf, canlı birincil hücrelerin izolasyonu, belirli hücre tiplerinin yapısını ve işlevini araştırmak için çok önemlidir. Yetişkin farede, özellikle omurilikte, mevcut protokoller genellikle yetişkin omuriliğe göre uyarlanmadığından, bu görev önemli zorluklar doğurur10,17. Bu protokol, hücre kültürü, akış sitometrisi, histoloji ve transkriptomik çalışmalar dahil olmak üzere çeşitli aşağı akış uygulamalarına uygulanabilen ver…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RNA analizleri için George Washington Üniversitesi Genomik Çekirdeği’nden Castle Raley’e ve RNA dizileme analizleri için Q2 Lab Solutions’a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü [hibe numarası F31NS117085] ve Dr. Robert H. Miller’a Vivian Gill Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Aldrich | T48402 | |
| 24 well tissue culture plate | Avantor | 10861-558 | |
| 2-Methyl-2-butanol, 98% | Thermo Fisher | A18304-0F | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Invitrogen | D1306 | 1:1000 |
| 45% glucose solution | Corning | 25-037-CI | |
| 5 mL capped tubes | Eppendorf | 30122305 | |
| Acetic acid | Sigma-Adlrich | A6283 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi | 103-107-677 | |
| Anti-ACSA2 Microbead Kit | Miltenyi | 130-097-679 | |
| Anti-Iba1 | Wako | 019-1974 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | |
| C57BL/6J wild-type (WT) mice | Jackson Laboratories | ||
| CD11b (Microglia) MicroBeads | Miltenyi | 130-093-634 | |
| Celltrics 30 µm filter | Sysmex Partec | 04-004-2326 | |
| Counting Chamber (Hemacytometer) | Hausser Scientific Co | 3200 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | D4527-40KU | |
| Distilled water | TMO | 15230001 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 11320074 | |
| DNase for RNA purification | Qiagen | 79254 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Thermo Fisher | 14040117 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | A5209401 | |
| GFAP antibody (mouse) | Santa Cruz | sc-33673 | 1:500 |
| GFAP antibody (rabbit) | Dako | Z0334 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgG | Invitrogen | a11032 | 1:500 |
| Goat anti-mouse 594 IgM | Invitrogen | a21044 | 1:300 |
| Goat anti-Rabbit 488 IgG | Invitrogen | a11008 | 1:500 |
| Iba1 antibody (rabbit) | Wako | 019-1974 | 1:500 |
| MACS Separator | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Masterflex C/L Pump System | Thermo Fisher | 77122-22 | |
| MEM | Corning | 15-015-CV | |
| Methanol | Sigma-Adlrich | 439193 | |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 | |
| MS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| O4 Antibody | R&D | MAB1326 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Plugged 9" glass pasteur pipette | VWR | 14672-412 | |
| RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
| Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 | Fisher scientific | 22-079-683 | |
| Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm | Kawasumi | D3K2-23G |
References
- Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7, 41-53 (2006).
- Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
- Badimon, A., et al. Negative feedback control of neuronal activity by microglia. Nature. 586, 417-423 (2020).
- Yanuck, S. F. Microglial phagocytosis of neurons: diminishing neuronal loss in traumatic, infectious, inflammatory, and autoimmune CNS disorders. Front Psychiatry. 10, 712 (2019).
- Xu, Y. J., Au, N. P. B., Ma, C. H. E. Functional and phenotypic diversity of microglia: implication for microglia-based therapies for alzheimer’s disease. Front Aging Neurosci. 14, 896852 (2022).
- Song, S., et al. Microglial-oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation. 19 (1), 246 (2022).
- Butler, C. A., et al. Microglial phagocytosis of neurons in neurodegeneration, and its regulation. J Neurochem. 158 (3), 621-639 (2021).
- Voskuhl, R. R., et al. Reactive astrocytes form scar-like perivascular barriers to leukocytes during adaptive immune inflammation of the CNS. J Neurosci. 29 (37), 11511-11522 (2009).
- Bordon, Y. MAFG activity in astrocytes drives CNS inflammation. Nature Reviews Immunology. 20, 205 (2020).
- Agalave, N. M., Lane, B. T., Mody, P. H., Szabo-Pardi, T. A., Burton, M. D. Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. J Neurosci Methods. 340, 108742 (2020).
- Kerstetter, A. E., Miller, R. H. Isolation and culture of spinal cord astrocytes. Methods in Molecular Biology. 814, 93-104 (2012).
- Hersbach, B. A., Simon, T., Masserdotti, G. Isolation and direct neuronal reprogramming of mouse astrocytes. J Vis Exp. (185), 64175 (2022).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents. J Vis Exp. (119), e55226 (2017).
- Davies, J., Denyer, T., Hadfield, J. Bioanalyzer chips can be used interchangeably for many analyses of DNA or RNA. Biotechniques. 60 (4), 197-199 (2016).
- Ahn, J. J., Islam, Y., Miller, R. H. Cell type specific isolation of primary astrocytes and microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 375, 109599 (2022).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. J Immunol Methods. 486, 112834 (2020).
- Neuschulz, A., et al. A single-cell RNA labeling strategy for measuring stress response upon tissue dissociation. Mol Syst Biol. 19, 11147 (2023).
- CB, S., et al. One brain-all cells: a comprehensive protocol to isolate all principal cns-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 1-25 (2021).
