Summary

Isolamento de Astrócitos Puros e Microglia da Medula Espinhal de Camundongos Adultos para Ensaios In Vitro e Estudos Transcriptômicos

Published: October 20, 2023
doi:

Summary

Este protocolo descreve o isolamento de astrócitos purificados e microglia da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando aplicações subsequentes, como análise de RNA e cultura celular. Inclui métodos e procedimentos detalhados de dissociação celular projetados para melhorar a qualidade e o rendimento das células isoladas.

Abstract

Astrócitos e micróglia desempenham papéis fundamentais no desenvolvimento do sistema nervoso central, respostas a lesões e doenças neurodegenerativas. Essas células altamente dinâmicas exibem respostas rápidas às mudanças ambientais e exibem significativa heterogeneidade em termos de morfologia, perfis transcricionais e funções. Embora nossa compreensão das funções das células gliais na saúde e na doença tenha avançado substancialmente, permanece a necessidade de análises in vitro, células-específicas conduzidas no contexto de insultos ou lesões para caracterizar de forma abrangente populações celulares distintas. O isolamento de células do camundongo adulto oferece várias vantagens sobre linhagens celulares ou animais neonatais, pois permite a análise de células em condições patológicas e em momentos específicos. Além disso, o foco no isolamento específico da medula espinhal, excluindo o envolvimento cerebral, permite a pesquisa de patologias da medula espinhal, incluindo encefalomielite autoimune experimental, lesão medular e esclerose lateral amiotrófica. Este protocolo apresenta um método eficiente para isolar astrócitos e micróglias da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando análises imediatas ou futuras com potenciais aplicações em estudos funcionais, moleculares ou proteômicos a jusante.

Introduction

Os astrócitos e a microglia são células gliais versáteis que desempenham papéis vitais no sistema nervoso central (SNC), englobando responsabilidades como regular a função neuronal, contribuir para o desenvolvimento do SNC, manter a barreira hematoencefálica e participar de outros processos críticos 1,2,3,4 . Além de seu papel na manutenção da homeostase, essas células gliais também desempenham um papel fundamental nos mecanismos de lesão e reparo. As microglias são bem conhecidas por suas capacidades fagocíticas, inflamatórias e migratórias após insultos ou lesões 5,6,7. As respostas astrocitárias na doença são igualmente diversas, englobando contribuições para a inflamação, a formação de cicatrizes gliais e o comprometimento da barreira hematoencefálica 8,9. Embora nossa compreensão dos papéis prejudiciais e reparadores da micróglia e dos astrócitos no SNC tenha crescido, a heterogeneidade inerente em sua estrutura e função requer ferramentas robustas para estudá-los em vários contextos.

Obter mais informações sobre os papéis da micróglia e dos astrócitos na saúde e na doença requer uma abordagem combinada de investigações in vivo e in vitro . Técnicas in vivo alavancam o intrincado crosstalk entre células gliais e neurônios dentro do SNC, enquanto metodologias in vitro mostram-se valiosas ao avaliar funções ou respostas unicelulares sob estímulos específicos. Cada método oferece vantagens únicas; Estudos in vitro são essenciais para a compreensão dos papéis específicos desses tipos celulares sem a entrada direta ou indireta de células vizinhas. Além disso, ensaios in vitro utilizando linhagens celulares imortais apresentam certos benefícios, incluindo a capacidade de proliferação indefinida, custo-benefício e facilidade de manutenção. No entanto, é importante notar que as células primárias imitam mais de perto as respostas fisiológicas normais em comparação com as linhagens celulares. Essa relevância fisiológica é crucial em ensaios funcionais e análises transcriptômicas.

Um dos desafios na obtenção de células primárias, particularmente da medula espinhal de camundongos adultos, está na quantidade e viabilidade das amostras. A medula espinhal adulta, sendo menor que o cérebro e contendo uma quantidade significativa de mielina, apresenta dificuldades únicas. Embora existam vários protocolos publicados detalhando o isolamento de células gliais puras e viáveis de animais neonatais ou do cérebro de camundongos adultos 10,11,12,13, essas metodologias podem não ser adequadas para o estudo de doenças e lesões específicas da medula espinhal. Neste protocolo, oferecemos um procedimento abrangente para isolar eficientemente a micróglia e os astrócitos puros e viáveis da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando aplicações a jusante em cultura de células e análises transcriptômicas. Este protocolo tem sido empregado com sucesso para isolar essas células de camundongos adultos com idade entre 10 semanas e 5 meses, demonstrando sua utilidade em vários contextos, incluindo estudos envolvendo camundongos knockout condicionais, respostas a drogas, pesquisa de desenvolvimento e modelos relacionados à idade.

Protocol

Todos os cuidados com os animais e procedimentos experimentais foram conduzidos após a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina e Ciências da Saúde da Universidade George Washington (Washington, D.C., EUA; IACUC#2021-004). O estudo utilizou camundongos selvagens machos e fêmeas C57BL/6J com idade entre 10 semanas e 5 meses, que foram obtidos de um fornecedor comercial (ver Tabela de Materiais) e alojados na Universidade George Washington. Uma visão geral do fluxo de …

Representative Results

Os métodos descritos neste protocolo permitem o isolamento de micróglia pura e viável e astrócitos da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando várias aplicações a jusante, incluindo ensaios funcionais ou histológicos in vitro e análise de RNA. Um isolamento bem sucedido para estudos in vitro resultará em proliferação celular contínua ao longo de vários dias. Células adultas exibem uma taxa de proliferação mais lenta em comparação com células iso…

Discussion

O isolamento de células primárias puras e viáveis é fundamental para investigar a estrutura e função de tipos celulares específicos. Em camundongos adultos, particularmente na medula espinhal, essa tarefa apresenta desafios significativos, pois os protocolos existentes muitas vezes não são adaptados à medula espinhaladulta10,17. Este protocolo apresenta um método eficiente e custo-efetivo aplicável a várias aplicações a jusante, incluindo cultura c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Castle Raley no George Washington University Genomics Core pelas análises de RNA e ao Q2 Lab Solutions pelas análises de sequenciamento de RNA. Este trabalho foi apoiado pelo National Institute of Neurological Disorders and Stroke [bolsa número F31NS117085] e pelo Vivian Gill Research Endowment ao Dr. Robert H. Miller. A Figura 1 foi criada com BioRender.com.

Materials

2,2,2-Tribromoethanol Sigma Aldrich T48402
24 well tissue culture plate Avantor 10861-558
2-Methyl-2-butanol, 98% Thermo Fisher A18304-0F
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride Invitrogen D1306 1:1000
45% glucose solution Corning 25-037-CI
5 mL capped tubes Eppendorf 30122305
Acetic acid Sigma-Adlrich A6283
Adult Brain Dissociation Kit Miltenyi 103-107-677
Anti-ACSA2 Microbead Kit Miltenyi 130-097-679
Anti-Iba1 Wako 019-1974
Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA
C57BL/6J wild-type (WT) mice  Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeads Miltenyi 130-093-634
Celltrics 30 µm filter Sysmex Partec 04-004-2326
Counting Chamber (Hemacytometer) Hausser Scientific Co 3200
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma Aldrich D4527-40KU
Distilled water TMO 15230001
DMEM/F12 Thermo Fisher 11320074
DNase for RNA purification Qiagen 79254
Dulbecco's phosphate-buffered saline Thermo Fisher 14040117
Fetal bovine serum Thermo Fisher A5209401
GFAP antibody (mouse) Santa Cruz sc-33673 1:500
GFAP antibody (rabbit) Dako Z0334 1:500
Goat anti-mouse 594 IgG Invitrogen a11032 1:500
Goat anti-mouse 594 IgM Invitrogen a21044 1:300
Goat anti-Rabbit 488 IgG Invitrogen a11008 1:500
Iba1 antibody (rabbit) Wako 019-1974 1:500
MACS Separator Miltenyi 130-042-303
Masterflex C/L Pump System Thermo Fisher 77122-22
MEM Corning 15-015-CV
Methanol Sigma-Adlrich 439193
Mounting Medium Vector Laboratories H-1000-10
MS Columns Miltenyi 130-042-401
O4 Antibody R&D MAB1326
Penicillin-Streptomycin Gibco 15070063
Plugged 9" glass pasteur pipette VWR 14672-412
RNeasy Plus Micro Kit Qiagen 74034
Royal-tek Surgical scalpel blade no. 10 Fisher scientific 22-079-683
Small Vein Infusion Set, 23 G x 19 mm Kawasumi D3K2-23G

References

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Cite This Article
Ahn, J. J., Miller, R. H., Islam, Y. Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies. J. Vis. Exp. (200), e65893, doi:10.3791/65893 (2023).

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