ショウジョウバエに対する下痢止め薬と植物抽出物の効果の評価

1.植物抽出物の調製 成木から Psidium guajava L.の葉30 枚を採取し、40°Cのオーブンで6日間乾燥させ、6日間風乾させ、40°Cのオーブンで4日間乾燥させ、最後に粉砕機またはコーヒーグラインダーで乾燥葉を粉砕してリーフパウダーを調製します。 乾燥粉末100gを96%エタノール1Lに24時間浸軟し、シェーカーを用いて連続撹拌する。植物残渣をもう一度同じプロセスにかけ、40°Cの減圧(175 mbar)下で真空ロータリーエバポレーターを使用して、得られたろ液を蒸発乾固させます。 植物抽出物をエタノールに溶解して、所望の濃度を得る。一連の濃度を試験することにより、(ここで説明するプロトコルを使用して)最適な濃度を決定します。植物抽出物については、100μg/mL、1mg/mL、10mg/mL、100mg/mLの濃度範囲で試験し、ハエの生存率に影響を与えないものを使用してください。純粋な化合物の場合は、0.05、0.5、5、50 mM12 の濃度範囲でテストします。 2.食品培地の調製 100 mLの蒸留水を測定し、4 gの砂糖と0.8 gの寒天をビーカーに注ぎます( 材料表を参照)。100°C(撹拌中)に加熱し、10分間保持します。 温度を80°Cに下げ、攪拌しながら小麦粉7.4gと酵母2.8gを加えます。少なくとも20分間加熱し、約80°Cの温度を攪拌して制御します。 モルデックス-プロピオン酸溶液(モルデックス1mLとプロピオン酸0.3gをよく混ぜる)を加えます。温度が約50°Cに下がるのを待ち、植物抽出液(1mg/mL)とブロモフェノールブルーパウダー0.5gを加えます。注意: テストする他の濃度の詳細については、セクション1.3.1を参照してください。 餌をペトリ皿に注ぎ、ペトリ皿がいっぱいになったら停止します(図1A)。ペトリ皿を室温(約3時間)まで冷ましてから蓋を閉め、4°Cの冷蔵庫で保存します。注意: ペトリ皿は、水分の蒸発を防ぐために、冷蔵庫に2週間以内保管する必要があります。 図1:糞便沈着試験の実験プロセスのデモンストレーション。 (A)培地を詰めたシャーレの画像。ハエが引っかかって移動できない隙間がないように、ペトリ皿に十分な餌があることを確認してください。ただし、表面を均等に覆うことができるように、ペトリ皿に食べ物を詰めすぎないでください。(B)プロトコルに記載されているヘラの画像。(C)プロトコルに記載されている糞便沈着検査の画像。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 3.ハエの準備 CO2タンク、針付きCO2ブローガン、フライパッド、絵筆、顕微鏡を準備します。フライステーションは、フライパッドとブローガンの両方にCO2を供給します。フライパッドはハエの選別に使用され、CO2ブローガンはバイアル、ボトル、ペトリ皿のハエの麻酔に使用されます。 蛹(少なくとも10個)を含むバイアルを選択してハエの年齢を標準化し、次の方法を使用して成虫のハエをチューブから廃棄します。バイアルを1つずつ逆さまにし、綿プラグとバイアルの側壁の間に針を挿入します。すべてのハエが綿栓で眠るまで、CO2 ブローガンで成虫のハエを麻酔します(麻酔には数秒が必要で、ブローガンを離してから麻酔作用は数秒間持続します)。70%エタノールが入ったガラス瓶の上のバイアルを開き、その中にハエを落とします。綿プラグでバイアルを閉じ、25°C、湿度60%のインキュベーターに保管します。インキュベーターのライトサイクルを12時間のライト/12時間のダークに設定します。 孵化後(最大8時間)、顕微鏡下で処女の雌と雄に分類し、仰向けにして生殖器を見てフライパッドします。女性の生殖器は、赤みを帯びた色の男性器に比べて淡いです。男性は、前脚にセックスコームと呼ばれる暗い剛毛があることでも識別できます。ハエを2つの新鮮なチューブ(1つはオス用、もう1つはメス用)に分け、25°Cで6〜8日間インキュベートします。注:25°Cでは、雌は孵化後約8時間処女のままです。 4.糞便沈着試験 ペトリ皿間の混乱を避けるために、対応する菌株、性別、および薬物をペトリ皿にラベル付けします。ペトリ皿を積み重ねます。 染色した食品が入ったペトリ皿を用意し、吸い取り紙の上で逆にして余分な液体を吸収します。へら(図1B)を使用して、食品を12等分に切り、へらを使用して1スライスを空のペトリ皿に入れます。注:反復数に応じて、カットするスライスの数は、ペトリ皿あたり最大20まで増やすことができます。各スライスは同じサイズにする必要があります。 すべてのハエが綿プラグで眠るまで、CO2 でハエを麻酔します。健康なハエを各シャーレに6匹移し(図1C)、すぐに蓋を閉め、インキュベーター(25°C、湿度60%、明暗12時間/暗時間12時間)に入れます。 実験中にハエがシャーレから逃げないように、シャーレの上部と下部のカバーをテープで貼り付けます。各テストグループについて、(少なくとも)6つの複製ペトリ皿を準備します。 ハエを24時間飼育した後、CO2 を使用して麻酔をかけ、ハエを70%エタノールで満たされた容器に移し、残りの餌を処分します。 ペトリ皿を保管し、手順5に進みます。 5. ペトリ皿の定量化 コンピューター上にフォルダーを設定し、実験株名、ハエの性別、使用した薬の種類を含めて名前を変更します。このフォルダ内に、Original、Cut、Analysisという名前のサブフォルダを作成します。 光学解像度 6,400 ppi の高解像度スキャナーを使用して、ペトリ皿をスキャンします。各ペトリ皿の上部カバーと下部カバーをスキャナーフィールドの中央に個別に配置して、個別にスキャンします。 コンピューターにインストールされているアプリケーションを開きます。コンピュータ画面にウェルカムウィンドウが開き、すべての一般設定が表示されます(図2A)。メモ: 詳細設定は変更しないでください。この手順は、 材料表で提案されているものと同じスキャナーを使用しているユーザーにのみ有効です。他のソフトウェアを使用する場合は、ガイドラインを参照してください。アプリケーション内のペトリ皿に、シーケンス番号、上部または下部のカバー、性別、および使用する食品の種類を含めて名前を付けます。手順5.1で設定したサブフォルダのオリジナルを選択します。 ペトリ皿をプレビューします。ウィンドウの下部にある [プレビュー ]をクリックし、スキャナーが事前スキャンされるまで数秒待つと、コンピューター画面にウィンドウが表示されます。画面に表示されている正方形を動かして、ペトリ皿を囲みます。 コンピュータ画面のウィンドウの右下にある[ スキャン ]をクリックすると、スキャンは選択したフォルダに画像として自動的に保存されます。 アプリケーション(オープンソースのフィジーアプリケーションなど)を使用して画像を切り抜き、アーティファクトや食品の残留物が堆積物と見なされないようにします。注: 次の手順は、フィジー アプリケーションを持っているユーザーにのみ有効です。他のソフトウェアを使用する場合は、ガイドラインを参照してください。フィジーアプリケーションを開き、ツールバーが画面に表示されるまで数秒待ちます。 切り抜く画像をツールバーにドラッグします。ツールバーの3番目のアイコン[多角形の選択]を選択し、画面をクリックして写真の不要な部分(色付きの円グラフ)を切り取り、円グラフの周りの角度をマークします(図2B-1,2)。注:画像内のトリミング領域を描写する場合、選択したフレームがシームレスに端から端まで接続されていることが不可欠です。 バーの左上にある「編集」をクリックし、外側の「塗りつぶし/クリア」をクリックします(図2B-3)。 写真を保存するには、バーの左上にある[ ファイル ]をクリックし、[ 名前を付けて保存]、[最後に Tiff]の順にクリックします。手順5.1でサブフォルダ Cut setを選択します。注:トリミングした画像を保存するときは、ファイル名に特殊文字(!、&、$、#、_,-,…など)が含まれていないか、文字が多すぎることを確認してください。 図2:糞便沈着検査のデータを分析するプロセスにおける重要なステップ。 (A)スキャンアプリケーションの設定情報を示すスクリーンショット。(B)フィジーアプリケーションを使用してトリミングされた画像。遺物や食品の残留物が堆積物と見なされないことを確認してください。(C) Excel_merge-v4 アプリケーションを開いたときのスクリーンショット。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 6. 糞尿のオープンソースソフトウェアの究極のリーダーを使用した糞便堆積物の識別 注:糞ソフトウェアの究極のリーダーの紹介と使用法は、 補足ファイル1にあります。 まず、T.U.R.D.ソフトウェアを開きます(補足図1)。新しい実験を作成し、ドキュメントに名前を付けて、手順 5.1 で設定したサブフォルダー Analysis に保存します。 [プレート]をクリックし、[プレートの追加]をクリックします。処理するペトリ皿を選択します。新しいウィンドウが開き、選択したプレートの名前と新しいパラメータが表示されます。ブロックサイズ、オフセット、最小サイズ、および最大サイズを設定します(補足図2)。 検出された糞便堆積物が正しいものであることを確認するには、 Plates(プレート)をクリックし、 Inspect Selected Plates(選択したプレートを検査)、 Graphics(グラフィックス)、View annotated images(注釈付き画像を表示 )の順にクリックします(補足図3)。ズームインして、カウントを確認します。分析に含めない鉱床が少ない場合は、除外する鉱床の選択を解除します(補足図4)。 処理する新しいイメージごとに、手順 6.3 からやり直します。 T.U.R.D.ソフトウェアでプレートを分析した後、Noをクリックしてハエの数を変更します。ハエ(補足図5)。 [ プレート]>[グループの編集]>[追加]をクリックしてグループ名を変更し、[ グループ 列]でグループ名を選択します。 「 >記述統計量の分析」>「グループの選択 」をクリックして、異なるレプリケート・データを個別にエクスポートします(補足図6)。すべてのスプレッドシートファイル(.csv)を同じフォルダに保管します。 すべてのファイル(手順6.7で取得)を一意のスプレッドシートに収集するには、アプリケーションExcel_merge-v4(補足コーディングファイル1)を開き、次の文が表示されるまで待ちます(.csvファイルを含む)フォルダーのパスを選択し、上記のフォルダーアドレスを貼り付けます。たとえば、パスを C:\Experiment\Fecal deposit test\ とし、キーボードで Enter キーを 2 回クリックします (図 2C)。その後、同じフォルダに新しいスプレッドシートファイルが作成されます。新しいスプレッドシート ファイルには、エクスポートされたすべてのファイルが別のシートに含まれます。 前のスプレッドシート ファイルで、別のシートを追加して、すべての反復の各パラメーターの平均を収集します (データの処理には VLOOKUP 関数を使用します)。一例を 付表1に示す。 p値を分析します。