Bildgebung vitaler und nicht-vitaler Hirnperizyten in Hirnschnitten nach Subarachnoidalblutung
Summary
Die Voruntersuchung bestätigt, dass eine Subarachnoidalblutung (SAB) zum Absterben der Hirnperizyten führt. Die Beurteilung der Perizytenkontraktilität nach SAB erfordert eine Unterscheidung zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Hirnperizyten. Daher wurde ein Verfahren entwickelt, mit dem lebensfähige und nicht lebensfähige Hirnperizyten gleichzeitig in Hirnschnitten markiert werden können, was die Beobachtung mit einem hochauflösenden konfokalen Mikroskop erleichtert.
Abstract
Perizyten sind wichtige Wandzellen, die sich in der zerebralen Mikrozirkulation befinden und für die aktive Modulation des zerebralen Blutflusses durch Kontraktilitätsanpassungen von entscheidender Bedeutung sind. Konventionell wird ihre Kontraktilität durch die Beobachtung morphologischer Verschiebungen und Änderungen des Kapillardurchmessers in der Nähe unter bestimmten Umständen gemessen. Die Fixierung nach dem Gewebe, die Bewertung der Vitalität und die anschließende Kontraktilität der abgebildeten Hirnperizyten werden jedoch beeinträchtigt. In ähnlicher Weise ist die genetische Markierung von Hirnperizyten nicht in der Lage, zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Perizyten zu unterscheiden, insbesondere bei neurologischen Erkrankungen wie Subarachnoidalblutungen (SAB), bei denen unsere vorläufige Untersuchung den Absterben von Hirnperizyten bestätigt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein zuverlässiges Protokoll entwickelt, das die gleichzeitige Fluoreszenzmarkierung von funktionellen und nicht-funktionellen Hirnperizyten in Hirnschnitten ermöglicht. Diese Markierungsmethode ermöglicht eine hochauflösende konfokale mikroskopische Visualisierung bei gleichzeitiger Markierung der Mikrogefäße des Hirnschnitts. Dieses innovative Protokoll bietet die Möglichkeit, die Kontraktilität der Gehirnperizyten, ihre Auswirkungen auf den Kapillardurchmesser und die Perizytenstruktur zu beurteilen. Die Untersuchung der Kontraktilität von Hirnperizyten im SAB-Kontext liefert ein aufschlussreiches Verständnis ihrer Auswirkungen auf die zerebrale Mikrozirkulation.
Introduction
Hirnperizyten, die sich durch ihre schlanken Ausstülpungen und hervorstehenden Zellkörper auszeichnen, umkreisen die Mikrozirkulation 1,2. Während die zerebrale Durchblutungsaugmentation überwiegend durch kapillare Dilatation angetrieben wird, weisen kleinere Arterien langsamere Dilatationsraten auf3. Die Kontraktilität der Perizyten übt einen Einfluss auf den Kapillardurchmesser und die Perizytenmorphologie aus und wirkt sich auf die Gefäßdynamik aus4. Die Kontraktion der Hirnperizyten führt zu einer Verengung der Kapillaren, und in pathologischen Szenarien kann eine übermäßige Kontraktion den Erythrozytenfluss behindern5. Verschiedene Faktoren, einschließlich Noradrenalin, das aus dem Locus coeruleus freigesetzt wird, können eine Kontraktion der Gehirnperizyten in den Kapillaren induzieren6. Perizyten spielen eine regulatorische Rolle im zerebralen Blutfluss und zeigen eine 20-HETE-Synthese, die als Sauerstoffsensor während der Hyperoxie7 dient. Die durch oxidativ-nitrativen Stress ausgelöste Kontraktion der Hirnperizyten wirkt sich nachteilig auf die Kapillaren aus5. Trotz In-vivo- und Ex-vivo-Untersuchungen zur Hirnperizytenkontraktion8 ist das Wissen über die Bildgebung von lebensfähigen und nicht-lebensfähigen Hirnperizyten in Hirnschnitten nach wie vor begrenzt.
Entscheidend ist, dass die Bildgebung der Hirnperizyten nach der Gewebefixierung deren Vitalität und die anschließende Beurteilung der Kontraktilität beeinträchtigt. Darüber hinaus kann in Szenarien wie neurologischen Störungen (z. B. Subarachnoidalblutung – SAB) bei der transgenen Markierung von Hirnperizyten nicht zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Perizyten unterschieden werden, wie unsere vorläufige SAB-induzierte Hirnperizytentodstudie9 bestätigt.
Um diese Herausforderungen zu meistern, setzten wir TO-PRO-3 zur Markierung lebender Perizyten ein, während verstorbene mit Propidiumiodid (PI) gefärbt wurden. Wir verwendeten hochauflösende konfokale Bildgebungstechnologien, um lebensfähige und nicht lebensfähige Hirnperizyten in Hirnschnitten zu visualisieren und gleichzeitig die Schichtaktivität während der Bildgebung zu erhalten. Dieser Artikel zielt darauf ab, eine reproduzierbare Methode zur Darstellung lebensfähiger und nicht lebensfähiger Hirnperizyten in Hirnschnitten vorzustellen, die als wertvolles Werkzeug dient, um den Einfluss von Hirnperizyten auf die zerebrale Mikrozirkulation nach SAB zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es wurden hochauflösende konfokale Bildgebungsverfahren zur Visualisierung von vitalen Hirnperizyten, nicht-vitalen Hirnperizyten und der Mikrogefäße in Hirnschnitten entwickelt. In akuten Hirnschnitten von Ratten werden zunächst Perizyten mit TO-PRO-311 markiert, gefolgt von mikrovaskulären Endothelzellen mit IB412; Anschließend erfolgt die Identifizierung der verstorbenen Perizyten mittels PI. Dieses Protokoll ist einfach, reproduzierbar und in hohem Maße anwendbar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (81960226,81760223) unterstützt; die Naturwissenschaftliche Stiftung der Provinz Yunnan (202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
References
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