Здесь мы представляем комплексную батарею поведенческих тестов, включая новый аквариум, шолинг и тесты социальных предпочтений, для эффективного определения потенциального нейротоксического воздействия химических веществ (например, метамфетамина и глифосата) на взрослых рыбок данио, использующих один аквариум. Этот метод имеет отношение к нейротоксичности и экологическим исследованиям.
Наличие невропатологических эффектов в течение многих лет являлось основной конечной точкой для оценки нейротоксичности химического вещества. Однако в последние 50 лет активно исследуется влияние химических веществ на поведение модельных видов. Постепенно поведенческие конечные точки были включены в протоколы нейротоксикологического скрининга, и эти функциональные результаты в настоящее время регулярно используются для выявления и определения потенциальной нейротоксичности химических веществ. Поведенческие анализы взрослых рыбок данио-рерио предоставляют стандартизированные и надежные средства для изучения широкого спектра поведения, включая тревогу, социальное взаимодействие, обучение, память и зависимость. Поведенческие анализы взрослых рыбок данио-рерио обычно включают в себя помещение рыб на экспериментальную арену, запись и анализ их поведения с помощью программного обеспечения для видеослежения. Рыбы могут подвергаться воздействию различных стимулов, а их поведение может быть количественно оценено с помощью различных показателей. Новый аквариумный тест является одним из наиболее принятых и широко используемых тестов для изучения тревожного поведения у рыб. Тесты на косяки и социальные предпочтения полезны при изучении социального поведения рыбок данио. Этот анализ особенно интересен, так как изучается поведение всего косяка. Эти анализы оказались высоковоспроизводимыми и чувствительными к фармакологическим и генетическим манипуляциям, что делает их ценными инструментами для изучения нейронных цепей и молекулярных механизмов, лежащих в основе поведения. Кроме того, эти анализы могут быть использованы при скрининге лекарств для выявления соединений, которые могут быть потенциальными модуляторами поведения.
В этой работе мы покажем, как применять поведенческие инструменты в нейротоксикологии рыб, анализируя действие метамфетамина, рекреационного наркотика, и глифосата, загрязнителя окружающей среды. Результаты демонстрируют значительный вклад поведенческих анализов на взрослых рыбках данио-рерио в понимание нейротоксикологических эффектов загрязнителей окружающей среды и лекарств, а также дают представление о молекулярных механизмах, которые могут изменять функцию нейронов.
Рыбка данио-рерио (Danio rerio) является популярным модельным видом позвоночных для экотоксикологии, разработки лекарств и фармакологических исследований безопасности. Его низкая стоимость, хорошо зарекомендовавший себя молекулярно-генетический инструментарий и сохранение ключевых физиологических процессов, участвующих в морфогенезе и поддержании нервной системы, делают рыбку данио-рерио идеальной животной моделью для исследований в области нейробиологии, включая нейроповеденческую токсикологию 1,2. Основной конечной точкой для оценки нейротоксичности химического вещества до недавнего времени было наличие невропатологических эффектов. Однако в последнее время поведенческие конечные точки были включены в протоколы нейротоксикологического скрининга, и эти функциональные исходы в настоящее время широко используются для выявления и определения потенциальной нейротоксичности химических веществ 3,4. Более того, поведенческие конечные точки очень важны с экологической точки зрения, поскольку даже очень незначительные изменения в поведении рыб могут поставить под угрозу выживание животного в естественныхусловиях.
Одним из наиболее часто используемых поведенческих тестов в исследованиях взрослых рыбок данио является новый резервуарный тест (NTT), который измеряет тревожное поведение 6,7. В этом анализе рыбы подвергаются воздействию новизны (рыбы помещаются в незнакомый аквариум), мягкого аверсивного раздражителя и наблюдаются их поведенческие реакции. НТТ используется в основном для оценки базальной локомоторной активности, геотаксиса, замерзания и беспорядочных движений рыб. Неустойчивая8 характеризуется резкими изменениями направления (зигзагами) и повторяющимися эпизодами ускорений (рывок). Это тревожная реакция, которая обычно наблюдается до или после эпизодов замерзания. Поведение замерзания соответствует полному прекращению движений рыбы (за исключением оперкулярных и глазных движений) во время нахождения на дне аквариума, в отличие от неподвижности, вызванной седацией, которая вызывает гиполокомоцию, акинезию и погружение8. Замерзание обычно связано с высоким уровнем стресса и тревоги, а также является частью покорного поведения. Сложное поведение является отличным индикатором состояния беспокойства животных. Былопоказано, что НТТ чувствительна к фармакологическим и генетическим манипуляциям, что делает ее ценным инструментом для изучения нейронной основы тревоги и связанных с ней расстройств.
Рыбки данио-рерио являются очень социальным видом, поэтому мы можем измерить широкий спектр социального поведения. Тест на мелководье (ST) и тест социальных предпочтений (SPT) являются наиболее часто используемыми тестами для оценки социального поведения10. ST измеряет склонность рыб группироватьсявместе 11 путем количественной оценки их пространственного поведения и моделей движения. ST полезен для изучения групповой динамики, лидерства, социального обучения и понимания социального поведения многих видов рыб12. SPT у взрослых рыбок данио-рерио был адаптирован из теста Кроули на социальную новизну для мышей13 и быстро стал популярным поведенческим тестом для изучения социального взаимодействия у этого модельноговида. Эти два теста также были адаптированы для использования в скрининговых тестах на наркотики и показали перспективность для выявления новых соединений, которые модулируют социальное поведение15,16.
В целом, поведенческие анализы у взрослых рыбок данио-рерио являются мощными инструментами, которые могут предоставить ценную информацию о механизмах поведения или нейрофенотипах активных соединенийи злоупотребляемых наркотиков. В этом протоколе подробно описывается, как реализовать эти поведенческие инструменты7 с базовыми материальными ресурсами и как применять их в анализах токсичности для характеристики эффектов широкого спектра нейроактивных соединений. Кроме того, мы увидим, что те же самые тесты могут быть применены для оценки нейроповеденческих эффектов острого воздействия нейроактивного соединения (метамфетамина), а также для характеристики этих эффектов после хронического воздействия концентраций пестицида (глифосата) в окружающей среде.
Характерное тревожное поведение, наблюдаемое при НТТ, положительно коррелировало с уровнями серотонина, проанализированными в мозге21. Например, после воздействия парахлорфенилаланина (PCPA), ингибитора биосинтеза 5-НТ, у рыб наблюдался положительный геотаксис, а также сниж?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана “Agencia Estatal de Investigación” Министерства науки и инноваций Испании (проект PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Центром передового опыта Северо Очоа (CEX2018-000794-S). Джульетт Бедроссианц получила грант (PRE2018-083513), софинансируемый правительством Испании и Европейским социальным фондом (ESF).
Aquarium Cube shape | Blau Aquaristic | 7782025 | Cubic Panoramic 10 (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm) |
Ethovision software | Noldus | Ethovision XT | Version 12.0 or newer |
GigE camera | Imaging Development Systems | UI-5240CP-NIR-GL | |
GraphPad Prism 9.02 | GraphPad software Inc | GraphPad Prism 9.02 | For Windows |
IDS camera manager | Imaging Development Systems | ||
LED backlight illumination | Quirumed | GP-G2 | |
SPSS Software | IBM | IBM SPSS v26 | |
uEye Cockpit software | Imaging Development Systems | version 4.90 |