Summary

単一水槽内の一連の行動試験を用いた成獣ダ ニオ・レリオ の神経毒性評価

Published: November 03, 2023
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Summary

ここでは、ゼブラフィッシュの成魚に対する化学物質(メタンフェタミンやグリホサートなど)の潜在的な神経毒性効果を1つの水槽で効果的に判定するために、新しい水槽、ショーリング、社会的選好試験など、包括的な行動試験バッテリーを紹介します。この方法は、神経毒性および環境研究に関連しています。

Abstract

神経病理学的影響の存在は、長年にわたり、化学物質の神経毒性を評価するための主要なエンドポイントであることが証明されました。しかし、過去50年間、モデル種の行動に対する化学物質の影響が活発に調査されてきました。次第に、行動エンドポイントが神経毒性学的スクリーニングプロトコルに組み込まれ、これらの機能的結果は現在、化学物質の潜在的な神経毒性を特定および決定するために日常的に使用されています。成体のゼブラフィッシュの行動アッセイは、不安、社会的相互作用、学習、記憶、依存症など、幅広い行動を研究するための標準化された信頼性の高い手段を提供します。成魚のゼブラフィッシュの行動アッセイでは、通常、実験場に魚を置き、ビデオ追跡ソフトウェアを使用してその行動を記録および分析します。魚はさまざまな刺激にさらされ、その行動はさまざまな指標を使用して定量化できます。新しい水槽試験は、魚の不安様行動を研究するために最も受け入れられ、広く使用されている試験の1つです。群れと社会的選好のテストは、ゼブラフィッシュの社会的行動を研究するのに役立ちます。このアッセイは、群れ全体の挙動が研究されているので、特に興味深いものです。これらのアッセイは、再現性が高く、薬理学的および遺伝子操作に対して感度が高いことが証明されており、行動の根底にある神経回路と分子メカニズムを研究するための貴重なツールとなっています。さらに、これらのアッセイは、行動の潜在的な調節因子である可能性のある化合物を特定するための薬物スクリーニングに使用できます。

本研究では、魚類の神経毒性学における行動ツールの適用方法を示し、娯楽用薬物であるメタンフェタミンと環境汚染物質であるグリホサートの効果を分析します。この結果は、ゼブラフィッシュの成体における行動アッセイが、環境汚染物質や薬物の神経毒性学的影響の理解に大きく貢献していることを実証するとともに、神経機能を変化させる可能性のある分子機構に関する手掛かりも得ている。

Introduction

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、生態毒性学、創薬、安全性薬理学の研究で人気のあるモデル脊椎動物種です。ゼブラフィッシュは、低コストで分子遺伝学的ツールが確立されており、神経系の形態形成と維持に関与する主要な生理学的プロセスの保存により、神経行動毒性学を含む神経科学研究に理想的な動物モデルとなっています1,2。化学物質の神経毒性を評価するための主な評価項目は、最近まで、神経病理学的影響の存在でした。しかし、最近では、行動エンドポイントが神経毒性学的スクリーニングプロトコルに組み込まれており、これらの機能的結果は、化学物質の潜在的な神経毒性を特定および決定するために一般的に使用されています3,4。さらに、行動エンドポイントは生態学的観点から非常に関連性が高く、魚の非常に穏やかな行動変化でさえ、自然条件での動物の生存を危険にさらす可能性があります5

ゼブラフィッシュの成体研究で最もよく使われる行動アッセイの1つに、不安様行動を測定する新しい水槽試験(NTT)があります6,7。このアッセイでは、魚は新規性(魚はなじみのない水槽に入れられます)、穏やかな嫌悪刺激にさらされ、それらの行動反応が観察されます。NTTは、主に魚類の基礎運動、走地行動、凍結、不規則な動きの評価に用いられています。不規則な8は、方向の急激な変化(ジグザグ)と加速の繰り返し(ダーティング)を特徴としています。これはアラーム反応であり、通常、凍結エピソードの前後に観察されます。凍結行動は、鎮静によって引き起こされる不動と区別されるように、水槽の底にいる間の魚の動きの完全な停止(手術および眼球の動きを除く)に対応し、低発運動、無動症、および沈没を引き起こします8。凍結は通常、ストレスや不安の高い状態に関連しており、従順な行動の一部でもあります。複雑な行動は、動物の不安状態を示す優れた指標です。NTTは、薬理学的および遺伝子操作に敏感であることが示されており9、不安および関連する障害の神経基盤を研究するための貴重なツールとなっています。

ゼブラフィッシュは社会性が高い種なので、さまざまな社会行動を測定できます。浅瀬テスト(ST)と社会的選好テスト(SPT)は、社会的行動を評価するために最もよく使用されるアッセイです10。STは、魚の空間的行動と移動パターンを定量化することにより、魚がグループ化される傾向を測定します11。STは、集団力学、リーダーシップ、社会的学習を研究し、多くの魚種の社会的行動を理解するのに役立ちます12。成体のゼブラフィッシュのSPTは、マウスの社会的新規性テストに対するクローリーの好みから適応され13、すぐにこのモデル種における社会的相互作用の研究のための一般的な行動アッセイになりました14。これら2つの試験は、薬物スクリーニングアッセイでの使用にも適応されており、社会的行動を調節する新規化合物の同定に有望であることが示されています15,16

一般に、成体のゼブラフィッシュにおける行動アッセイは、活性化合物や乱用薬物の行動メカニズムや神経表現型に関する貴重な情報を提供できる強力なツールです17。このプロトコルでは、これらの行動ツール7 を基本的な材料資源で実装する方法と、幅広い神経活性化合物の効果を特徴付けるために毒性アッセイに適用する方法を詳しく説明します。さらに、同じテストを適用して、神経活性化合物(メタンフェタミン)への急性曝露の神経行動学的影響を評価するだけでなく、農薬(グリホサート)の環境濃度への慢性曝露後のこれらの影響を特徴付けることもできます。

Protocol

倫理基準を厳格に遵守することで、実験に使用されたゼブラフィッシュの福祉と適切な処理が保証されます。すべての実験手順は、動物実験委員会(CID-CSIC)によって確立されたガイドラインに基づいて実施されました。以下に示すプロトコルと結果は、地方自治体から付与されたライセンス(契約番号11336)に基づいて実施されました。 1.行動実験用動物飼育施設<…

Representative Results

このセクションでは、魚類の神経毒性学におけるこれらの行動ツールの可能なアプリケーションについて見ていきます。以下の結果は、娯楽用薬物であるメタンフェタミン(METH)の急性または過食症の影響、および水生生態系に見られる主要な除草剤の1つであるグリホサートの亜慢性効果の特徴付けに対応しています。 成魚ゼブラフィッシュにおけるメタンフェタ?…

Discussion

NTTで観察された特徴的な不安行動は、脳で分析されたセロトニンレベルと正の相関がありました21。例えば、5-HT生合成の阻害剤であるパラクロロフェニルアラニン(PCPA)に曝露した後、魚は陽性のジオタキシシスと脳の5-HTレベルの低下を示し22、METHで得られた結果と非常によく似た結果を示しました。したがって、METHに曝露されたゼブラフィッシュにおけ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、スペイン科学イノベーション省の「Agencia Estatal de Investigación」(プロジェクトPID2020-113371RB-C21)、IDAEA-CSIC、セベロオチョアセンターオブエクセレンス(CEX2018-000794-S)の支援を受けました。Juliette Bedrossiantzは、スペイン政府と欧州社会基金(ESF)が共同出資する博士号助成金(PRE2018-083513)の支援を受けました。

Materials

Aquarium Cube shape Blau Aquaristic 7782025 Cubic Panoramic 10  (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)
Ethovision software Noldus Ethovision XT Version 12.0 or newer
GigE camera Imaging Development Systems UI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02 GraphPad software Inc GraphPad Prism 9.02  For Windows
IDS camera manager Imaging Development Systems
LED backlight illumination Quirumed GP-G2
SPSS Software IBM IBM SPSS v26
uEye Cockpit software  Imaging Development Systems version 4.90

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Bedrossiantz, J., Prats, E., Raldúa, D. Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank. J. Vis. Exp. (201), e65869, doi:10.3791/65869 (2023).

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