Summary

Valutazione della neurotossicità in Danio rerio adulto utilizzando una batteria di test comportamentali in un singolo serbatoio

Published: November 03, 2023
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Summary

Qui, presentiamo una batteria di test comportamentali completa, tra cui il nuovo serbatoio, Shoaling e i test di preferenza sociale, per determinare efficacemente i potenziali effetti neurotossici delle sostanze chimiche (ad esempio, metanfetamina e glifosato) sul pesce zebra adulto utilizzando un singolo acquario. Questo metodo è rilevante per la neurotossicità e la ricerca ambientale.

Abstract

La presenza di effetti neuropatologici si è rivelata, per molti anni, il principale endpoint per valutare la neurotossicità di una sostanza chimica. Tuttavia, negli ultimi 50 anni, gli effetti delle sostanze chimiche sul comportamento delle specie modello sono stati attivamente studiati. Progressivamente, gli endpoint comportamentali sono stati incorporati nei protocolli di screening neurotossicologico e questi risultati funzionali sono ora utilizzati di routine per identificare e determinare la potenziale neurotossicità delle sostanze chimiche. I saggi comportamentali nel pesce zebra adulto forniscono un mezzo standardizzato e affidabile per studiare un’ampia gamma di comportamenti, tra cui ansia, interazione sociale, apprendimento, memoria e dipendenza. I saggi comportamentali nel pesce zebra adulto in genere comportano il posizionamento del pesce in un’arena sperimentale e la registrazione e l’analisi del loro comportamento utilizzando un software di tracciamento video. I pesci possono essere esposti a vari stimoli e il loro comportamento può essere quantificato utilizzando una varietà di metriche. Il nuovo test della vasca è uno dei test più accettati e ampiamente utilizzati per studiare il comportamento ansioso nei pesci. I test di shoaling e di preferenza sociale sono utili per studiare il comportamento sociale del pesce zebra. Questo saggio è particolarmente interessante in quanto viene studiato il comportamento dell’intera secca. Questi saggi hanno dimostrato di essere altamente riproducibili e sensibili alle manipolazioni farmacologiche e genetiche, rendendoli strumenti preziosi per lo studio dei circuiti neurali e dei meccanismi molecolari alla base del comportamento. Inoltre, questi saggi possono essere utilizzati nello screening farmacologico per identificare composti che possono essere potenziali modulatori del comportamento.

In questo lavoro mostreremo come applicare gli strumenti comportamentali nella neurotossicologia dei pesci, analizzando l’effetto della metanfetamina, una droga ricreativa, e del glifosato, un inquinante ambientale. I risultati dimostrano il contributo significativo dei saggi comportamentali nel pesce zebra adulto alla comprensione degli effetti neurotossicologici degli inquinanti ambientali e dei farmaci, oltre a fornire informazioni sui meccanismi molecolari che possono alterare la funzione neuronale.

Introduction

Il pesce zebra (Danio rerio) è una specie di vertebrato modello popolare per l’ecotossicologia, la scoperta di farmaci e gli studi di farmacologia di sicurezza. Il suo basso costo, gli strumenti genetici molecolari ben consolidati e la conservazione dei processi fisiologici chiave coinvolti nella morfogenesi e nel mantenimento del sistema nervoso rendono il pesce zebra un modello animale ideale per la ricerca neuroscientifica, inclusa la tossicologia neurocomportamentale 1,2. L’endpoint principale per valutare la neurotossicità di una sostanza chimica era, fino a poco tempo fa, la presenza di effetti neuropatologici. Ultimamente, tuttavia, gli endpoint comportamentali sono stati incorporati nei protocolli di screening neurotossicologico e questi risultati funzionali sono ora comunemente utilizzati per identificare e determinare la potenziale neurotossicità delle sostanze chimiche 3,4. Inoltre, gli endpoint comportamentali sono molto rilevanti da un punto di vista ecologico, in quanto anche un cambiamento comportamentale molto lieve nei pesci potrebbe mettere in pericolo la sopravvivenza dell’animale in condizioni naturali5.

Uno dei saggi comportamentali più utilizzati nella ricerca sul pesce zebra adulto è il nuovo tank test (NTT), che misura il comportamento ansioso 6,7. In questo saggio, i pesci sono esposti a novità (i pesci sono posti in una vasca sconosciuta), a un lieve stimolo avversivo e si osservano le loro risposte comportamentali. L’NTT viene utilizzato principalmente per valutare l’attività locomotoria basale, la geotassia, il congelamento e i movimenti irregolari dei pesci. Erratic8 è caratterizzato da bruschi cambi di direzione (zigzaging) e ripetuti episodi di accelerazioni (darting). È una reazione di allarme e di solito si osserva prima o dopo episodi di congelamento. Il comportamento di congelamento corrisponde a una completa cessazione dei movimenti del pesce (ad eccezione dei movimenti opercolari e oculari) sul fondo della vasca, distinto dall’immobilità causata dalla sedazione, che provoca ipolocomozione, acinesia e affondamento8. Il congelamento è solitamente correlato a un elevato stato di stress e ansia e fa anche parte del comportamento sottomesso. I comportamenti complessi sono ottimi indicatori dello stato d’ansia degli animali. È stato dimostrato che la NTT è sensibile alla manipolazione farmacologica e genetica9, il che la rende uno strumento prezioso per studiare le basi neurali dell’ansia e dei disturbi correlati.

Il pesce zebra è una specie altamente sociale, quindi possiamo misurare una vasta gamma di comportamenti sociali. Il test di shoaling (ST) e il test di preferenza sociale (SPT) sono i test più utilizzati per valutare il comportamento sociale10. L’ST misura la tendenza dei pesci a raggrupparsi11 quantificando il loro comportamento spaziale e i loro schemi di movimento. ST è utile per studiare le dinamiche di gruppo, la leadership, l’apprendimento sociale e la comprensione del comportamento sociale di molte specie ittiche12. L’SPT nel pesce zebra adulto è stato adattato dalla preferenza di Crawley per il test di novità sociale per i topi13 ed è diventato rapidamente un test comportamentale popolare per lo studio dell’interazione sociale in questa specie modello14. Questi due test sono stati anche adattati per l’uso in saggi di screening farmacologico e si sono dimostrati promettenti per l’identificazione di nuovi composti che modulano il comportamento sociale15,16.

In generale, i saggi comportamentali nel pesce zebra adulto sono strumenti potenti che possono fornire preziose informazioni sui meccanismi comportamentali o sui neurofenotipi dei composti attivi e delle droghe abusate17. Questo protocollo descrive in dettaglio come implementare questi strumenti comportamentali7 con risorse materiali di base e come applicarli nei saggi di tossicità per caratterizzare gli effetti di un’ampia gamma di composti neuroattivi. Inoltre, vedremo che gli stessi test possono essere applicati per valutare gli effetti neurocomportamentali dell’esposizione acuta a un composto neuroattivo (metanfetamina) ma anche per caratterizzare questi effetti dopo l’esposizione cronica a concentrazioni ambientali di un pesticida (glifosato).

Protocol

Il rigoroso rispetto delle norme etiche garantisce il benessere e il corretto trattamento del pesce zebra utilizzato per la sperimentazione. Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite secondo le linee guida stabilite dai Comitati Istituzionali per la Cura e l’Uso degli Animali (CID-CSIC). I protocolli e i risultati presentati di seguito sono stati eseguiti con la licenza concessa dal governo locale (numero di accordo 11336). 1. Stabulazione degli animali per test comportamentali…

Representative Results

In questa sezione, esamineremo alcune possibili applicazioni di questi strumenti comportamentali nella neurotossicologia dei pesci. I seguenti risultati corrispondono alla caratterizzazione degli effetti acuti o di abbuffata della metanfetamina (METH), una droga ricreativa, e degli effetti sub-cronici del glifosato, uno dei principali erbicidi presenti negli ecosistemi acquatici. Caratterizzazione di un modello di neurotossicità da metanfetamina in zebrafish adultoNel val…

Discussion

I comportamenti ansiosi caratteristici osservati nella NTT sono stati correlati positivamente con i livelli di serotonina analizzati nel cervello21. Ad esempio, dopo l’esposizione alla para-clorofenilalalanina (PCPA), un inibitore della biosintesi della 5-HT, i pesci hanno mostrato geotassi positiva e livelli cerebrali di 5-HTdiminuiti 22, risultati molto simili a quelli ottenuti con la metanfetania. Pertanto, la diminuzione dei livelli di serotonina cerebrale e la visualiz…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da “Agencia Estatal de Investigación” del Ministero spagnolo della Scienza e dell’Innovazione (progetto PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Centro di eccellenza Severo Ochoa (CEX2018-000794-S). Juliette Bedrossiantz è stata sostenuta da una borsa di dottorato (PRE2018-083513) cofinanziata dal governo spagnolo e dal Fondo sociale europeo (FSE).

Materials

Aquarium Cube shape Blau Aquaristic 7782025 Cubic Panoramic 10  (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)
Ethovision software Noldus Ethovision XT Version 12.0 or newer
GigE camera Imaging Development Systems UI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02 GraphPad software Inc GraphPad Prism 9.02  For Windows
IDS camera manager Imaging Development Systems
LED backlight illumination Quirumed GP-G2
SPSS Software IBM IBM SPSS v26
uEye Cockpit software  Imaging Development Systems version 4.90

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Bedrossiantz, J., Prats, E., Raldúa, D. Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank. J. Vis. Exp. (201), e65869, doi:10.3791/65869 (2023).

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