Bewertung der Neurotoxizität bei erwachsenem Danio rerio mit einer Reihe von Verhaltenstests in einem einzigen Tank
Summary
Hier stellen wir eine umfassende Verhaltenstestbatterie vor, einschließlich der neuartigen Aquarien-, Schwarm- und Sozialpräferenztests, um die potenziellen neurotoxischen Wirkungen von Chemikalien (z. B. Methamphetamin und Glyphosat) auf erwachsene Zebrafische mit einem einzigen Tank effektiv zu bestimmen. Diese Methode ist für die Neurotoxizität und die Umweltforschung relevant.
Abstract
Das Vorhandensein neuropathologischer Wirkungen erwies sich viele Jahre lang als Hauptendpunkt für die Beurteilung der Neurotoxizität einer chemischen Substanz. In den letzten 50 Jahren wurden jedoch die Auswirkungen von Chemikalien auf das Verhalten von Modellarten aktiv untersucht. Nach und nach wurden Verhaltensendpunkte in neurotoxikologische Screening-Protokolle integriert, und diese funktionellen Ergebnisse werden heute routinemäßig verwendet, um die potenzielle Neurotoxizität von Chemikalien zu identifizieren und zu bestimmen. Verhaltensassays bei erwachsenen Zebrafischen bieten ein standardisiertes und zuverlässiges Mittel, um eine breite Palette von Verhaltensweisen zu untersuchen, darunter Angstzustände, soziale Interaktion, Lernen, Gedächtnis und Sucht. Verhaltenstests bei erwachsenen Zebrafischen beinhalten in der Regel, dass die Fische in eine Versuchsarena gesetzt und ihr Verhalten mit Hilfe von Video-Tracking-Software aufgezeichnet und analysiert wird. Fische können verschiedenen Reizen ausgesetzt sein, und ihr Verhalten kann mit einer Vielzahl von Metriken quantifiziert werden. Der neuartige Aquarientest ist einer der am meisten akzeptierten und am weitesten verbreiteten Tests zur Untersuchung von angstähnlichem Verhalten bei Fischen. Die Schwarm- und Sozialpräferenztests sind nützlich, um das Sozialverhalten von Zebrafischen zu untersuchen. Dieser Assay ist besonders interessant, da das Verhalten des gesamten Schwarms untersucht wird. Diese Assays haben sich als hochgradig reproduzierbar und empfindlich gegenüber pharmakologischen und genetischen Manipulationen erwiesen, was sie zu wertvollen Werkzeugen für die Untersuchung der neuronalen Schaltkreise und molekularen Mechanismen macht, die dem Verhalten zugrunde liegen. Darüber hinaus können diese Assays im Arzneimittel-Screening verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die potenzielle Modulatoren des Verhaltens sein können.
In dieser Arbeit werden wir zeigen, wie Verhaltenswerkzeuge in der Neurotoxikologie von Fischen angewendet werden können, indem wir die Wirkung von Methamphetamin, einer Freizeitdroge, und Glyphosat, einem Umweltschadstoff, analysieren. Die Ergebnisse zeigen den signifikanten Beitrag von Verhaltensassays in erwachsenen Zebrafischen zum Verständnis der neurotoxikologischen Wirkungen von Umweltschadstoffen und Medikamenten und liefern Einblicke in die molekularen Mechanismen, die die neuronale Funktion verändern können.
Introduction
Der Zebrafisch (Danio rerio) ist eine beliebte Modell-Wirbeltierart für Ökotoxikologie, Arzneimittelforschung und sicherheitspharmakologische Studien. Seine geringen Kosten, die gut etablierten molekulargenetischen Werkzeuge und die Konservierung wichtiger physiologischer Prozesse, die an der Morphogenese und Aufrechterhaltung des Nervensystems beteiligt sind, machen den Zebrafisch zu einem idealen Tiermodell für die neurowissenschaftliche Forschung, einschließlich der neurobehavioralen Toxikologie 1,2. Der Hauptendpunkt für die Bewertung der Neurotoxizität einer Chemikalie war bis vor kurzem das Vorhandensein neuropathologischer Wirkungen. In jüngster Zeit wurden jedoch Verhaltensendpunkte in neurotoxikologische Screening-Protokolle aufgenommen, und diese funktionellen Ergebnisse werden heute häufig verwendet, um die potenzielle Neurotoxizität von Chemikalien zu identifizieren und zu bestimmen 3,4. Darüber hinaus sind Verhaltensendpunkte aus ökologischer Sicht von hoher Relevanz, da bereits eine sehr leichte Verhaltensänderung bei Fischen das Überleben des Tieres unter natürlichen Bedingungen gefährden könnte5.
Einer der am häufigsten verwendeten Verhaltenstests in der adulten Zebrafischforschung ist der neuartige Tanktest (NTT), der angstähnliches Verhalten misst 6,7. In diesem Assay werden die Fische einer Neuheit ausgesetzt (Fische werden in ein unbekanntes Becken gesetzt), einem milden aversiven Reiz und ihre Verhaltensreaktionen beobachtet. NTT wird hauptsächlich zur Beurteilung der basalen Bewegungsaktivität, Geotaxis, des Einfrierens und der unberechenbaren Bewegungen von Fischen verwendet. Findling8 ist gekennzeichnet durch abrupte Richtungswechsel (Zickzack) und wiederholte Beschleunigungsepisoden (Darting). Es handelt sich um eine Alarmreaktion, die in der Regel vor oder nach dem Einfrieren beobachtet wird. Das Gefrierverhalten entspricht einer vollständigen Einstellung der Bewegungen des Fisches (mit Ausnahme der operkulären und okulären Bewegungen) auf dem Boden des Beckens, im Unterschied zu einer durch Sedierung verursachten Immobilität, die Hypolokomotion, Akinesie und Sinken verursacht8. Frieren ist in der Regel mit einem hohen Stress- und Angstzustand verbunden und gehört auch zum unterwürfigen Verhalten. Komplexe Verhaltensweisen sind hervorragende Indikatoren für den Angstzustand von Tieren. Es hat sich gezeigt, dass NTT empfindlich auf pharmakologische und genetische Manipulation reagiert9, was es zu einem wertvollen Werkzeug für die Untersuchung der neuronalen Grundlagen von Angstzuständen und verwandten Störungen macht.
Zebrafische sind eine sehr soziale Spezies, so dass wir ein breites Spektrum an sozialem Verhalten messen können. Der Shoaling-Test (ST) und der Social Preference Test (SPT) sind die am häufigsten verwendeten Assays zur Beurteilung des Sozialverhaltens10. Der ST misst die Neigung von Fischen, sich zu gruppieren11, indem er ihr räumliches Verhalten und ihre Bewegungsmuster quantifiziert. ST ist nützlich, um Gruppendynamik, Führung, soziales Lernen und das Verständnis des Sozialverhaltens vieler Fischarten zu untersuchen12. Der SPT bei erwachsenen Zebrafischen wurde von Crawleys Präferenz für den sozialen Neuheitstest für Mäuse übernommen13 und wurde schnell zu einem beliebten Verhaltenstest für die Untersuchung der sozialen Interaktion bei dieser Modellspezies14. Diese beiden Tests wurden auch für den Einsatz in Drogenscreening-Assays angepasst und haben sich als vielversprechend für die Identifizierung neuer Verbindungen erwiesen, die das Sozialverhalten modulieren15,16.
Im Allgemeinen sind Verhaltensassays bei erwachsenen Zebrafischen leistungsfähige Werkzeuge, die wertvolle Informationen über die Verhaltensmechanismen oder die Neurophänotypen von Wirkstoffen und missbrauchten Medikamenten liefern können17. In diesem Protokoll wird beschrieben, wie diese Verhaltenswerkzeuge7 mit grundlegenden materiellen Ressourcen implementiert werden und wie sie in Toxizitätsassays angewendet werden, um die Auswirkungen einer Vielzahl neuroaktiver Verbindungen zu charakterisieren. Darüber hinaus werden wir sehen, dass die gleichen Tests angewendet werden können, um die neurologischen Auswirkungen einer akuten Exposition gegenüber einer neuroaktiven Verbindung (Methamphetamin) zu bewerten, aber auch, um diese Auswirkungen nach chronischer Exposition gegenüber Umweltkonzentrationen eines Pestizids (Glyphosat) zu charakterisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Charakteristisches Angstverhalten, das bei NTT beobachtet wurde, wurde positiv mit dem Serotoninspiegel korreliert, der im Gehirn analysiert wurde21. Zum Beispiel zeigten Fische nach der Exposition gegenüber para-Chlorphenylalanin (PCPA), einem Inhibitor der 5-HT-Biosynthese, positive Geotaxis sowie verminderte 5-HT-Spiegel im Gehirn22, Ergebnisse, die denen mit METH sehr ähnlich sind. Daher deutet die Abnahme des Serotoninspiegels im Gehirn und die Anzeige positiver Geot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von der “Agencia Estatal de Investigación” des spanischen Ministeriums für Wissenschaft und Innovation (Projekt PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Severo Ochoa Centre of Excellence (CEX2018-000794-S). Juliette Bedrossiantz wurde durch ein Promotionsstipendium (PRE2018-083513) unterstützt, das von der spanischen Regierung und dem Europäischen Sozialfonds (ESF) kofinanziert wurde.
Materials
| Aquarium Cube shape | Blau Aquaristic | 7782025 | Cubic Panoramic 10 (10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm) |
| Ethovision software | Noldus | Ethovision XT | Version 12.0 or newer |
| GigE camera | Imaging Development Systems | UI-5240CP-NIR-GL | |
| GraphPad Prism 9.02 | GraphPad software Inc | GraphPad Prism 9.02 | For Windows |
| IDS camera manager | Imaging Development Systems | ||
| LED backlight illumination | Quirumed | GP-G2 | |
| SPSS Software | IBM | IBM SPSS v26 | |
| uEye Cockpit software | Imaging Development Systems | version 4.90 |
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