Ex vivo Drosophila larva beynindeki monokarboksilatların ve diğer ilgili metabolitlerin genetik olarak kodlanmış sensörler kullanılarak görselleştirilmesi
Summary
Burada, ex-vivo Drosophila larva beyin preparatında genetik olarak kodlanmış Förster rezonans enerji transferi tabanlı sensörler kullanarak glial hücrelerde ve nöronlarda monokarboksilatların, glikozun ve ATP’nin taşınmasını görselleştirmek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Elektriksel aktiviteye bağlı olarak beyinlerin yüksek enerji gereksinimleri en ayırt edici özelliklerinden biridir. Bu gereksinimler, glikozdan ve monokarboksilatlar laktat ve piruvat gibi metabolitlerinden ATP üretimi ile karşılanır. Bu sürecin nasıl düzenlendiği veya özellikle Drosophila’daki kilit oyuncuların kim olduğu hala belirsiz.
Genetik olarak kodlanmış Förster rezonans enerji transferi tabanlı sensörleri kullanarak, ex-vivo Drosophila larva beyin preparatında glial hücrelerde ve nöronlarda monokarboksilatların ve glikozun taşınmasını ölçmek için basit bir yöntem sunuyoruz. Protokol, sensörlerden birini bir cam lamele ifade eden bir larva beyninin nasıl kesileceğini ve yapıştırılacağını açıklar.
Glial hücrelerde daha önce tanımlanmış monokarboksilat taşıyıcılarını yıkarak larva beyinlerinde laktat taşınımının ölçüldüğü bütün bir deneyin sonuçlarını sunuyoruz. Ayrıca, nöronal aktivitenin nasıl hızla artırılacağını ve aktif beyindeki metabolit değişikliklerinin nasıl izleneceğini gösteriyoruz. Gerekli tüm bilgileri sağlayan tarif edilen yöntem, diğer Drosophila canlı dokularını analiz etmek için kullanılabilir.
Introduction
Beyin, nöronal elektrik sinyali üretimi ve iletiminin yanı sıra sinaptik iletimin neden olduğu nöronlardaki iyon gradyanlarını geri yüklemenin yüksek maliyeti nedeniyle yüksek enerji gereksinimlerine sahiptir 1,2. Bu yüksek enerji talebinin uzun zamandır ATP3 üretmek için glikozun sürekli oksidasyonu ile karşılandığı düşünülüyordu. Kan-beyin bariyerindeki spesifik taşıyıcılar, kandaki glikozu beyne aktarır. Sabit glisemik seviyeler, beynin sabit bir glikoz kaynağı almasını sağlar4. İlginç bir şekilde, artan deneysel kanıtlar, laktat ve piruvat gibi glikoz metabolizmasından türetilen moleküllerin beyin hücrelerinin enerji üretiminde önemli bir rol oynadığını göstermektedir 5,6. Bununla birlikte, bu moleküllerin enerji üretimi için ne kadar önemli olduğu ve beyindeki hangi hücrelerin bunları ürettiği veya kullandığı konusunda hala bazı tartışmalar vardır 7,8. Bu görev için gerekli olan yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip uygun moleküler araçların eksikliği, bu tartışmanın tamamen çözülmesini engelleyen önemli bir konudur.
Birkaç tasarlanmış floresan metabolik sensörün geliştirilmesi ve uygulanması, metabolitlerin nerede ve nasıl üretildiği ve kullanıldığı ile metabolik akışların bazal ve yüksek nöronal aktivite sırasında nasıl oluştuğuna dair anlayışımızda dikkate değer bir artışa neden olmuştur9. ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (glikoz), Laconic (laktat) ve Pyronic (piruvat) gibi Förster rezonans enerji transferi (FRET) mikroskobuna dayalı genetik olarak kodlanmış metabolik sensörler, beyin enerji metabolizmasını anlamamıza katkıda bulunmuştur 10,11,12,13. Bununla birlikte, canlı hayvanlar veya dokular üzerinde deney yapmak için gereken yüksek maliyetler ve karmaşık ekipman nedeniyle, omurgalı modellerindeki sonuçlar hala öncelikle hücre kültürleriyle (glial hücreler ve nöronlar) sınırlıdır.
Bu sensörleri ifade etmek için Drosophila modelinin ortaya çıkan kullanımı, temel metabolik özelliklerin türler arasında korunduğunu ve işlevlerinin bu araçla kolayca ele alınabileceğini ortaya koymuştur. Daha da önemlisi, Drosophila modeli, glikoz ve laktat/piruvatın sinek beyninde nasıl taşındığına ve metabolize edildiğine, monokarboksilat tüketimi ile hafıza oluşumu arasındaki bağlantıya ve nöral aktivite ve metabolik akıştaki artışların nasıl örtüştüğünün dikkate değer gösterimine ışık tutmuştur 14,15,16,17 . Larva beyninde ifade edilen genetik olarak kodlanmış FRET sensörlerini kullanarak monokarboksilat, glikoz ve ATP seviyelerini ölçmek için burada sunulan yöntem, araştırmacıların Drosophila’nın beyninin diğer hayvanların beyinlerine uygulanabilecek enerjiyi nasıl kullandığı hakkında daha fazla bilgi edinmelerini sağlar.
Bu yöntemin glial hücrelerde ve nöronlarda laktat ve glikozu tespit etmede etkili olduğunu ve bir monokarboksilat taşıyıcısının (Chaski) glial hücrelere laktat ithalatında rol oynadığını gösterdik. Ayrıca, bir GABAA reseptör antagonistinin banyo uygulamasıyla kolayca indüklenebilen, artan nöronal aktivite sırasında metabolit değişikliklerini incelemek için basit bir yöntem gösteriyoruz. Son olarak, bu metodolojinin, yağ cisimleri gibi diğer metabolik olarak önemli dokularda monokarboksilat ve glikoz taşınmasını ölçmek için kullanılabileceğini gösteriyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beyin metabolizmasının incelenmesi için Drosophila modelinin kullanımı nispeten yenidir26 ve memeli metabolizması ile beklenenden daha fazla özelliği paylaştığı gösterilmiştir, bu da öncelikle birincil nöron kültürlerinde veya beyin dilimlerinde in vitro olarak incelenmiştir. Drosophila , araştırmacıların indüklenen aktivitenin neden olduğu metabolik değişiklikleri gerçek zamanlı olarak görselleştirmelerine veya hatta duyusal bir uyarana ya…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sierralta Lab’ın tüm üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma FONDECYT-Iniciación 11200477 (AGG’ye) ve FONDECYT Regular 1210586 (JS’ye) tarafından desteklenmiştir. UAS-FLII12Pglu700μδ6 (glikoz sensörü), CNRS-Paris’ten Pierre-Yves Plaçais ve Thomas Preat tarafından bağışlanmıştır.
Materials
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD Camera ORCA-R2 | Hamamatsu | – | |
| Cell-R Software | Olympus | – | |
| CG-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver |
| Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2-emission splitting system | Photometrics | – | |
| Glass coverslips (25 mm diameter) | Marienfeld | 111650 | Germany |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8,0,2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ software | National Institues of Health | Version 1,53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective | Olympus | – | |
| Methylparaben | Sigma | H5501 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Motor neuron driver | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675S | CAUTION-Fatal if swallowed |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Glial cell driver (all) |
| Sodium Lactate | Sigma | 71718 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI | Olympus | – | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Trehalose | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | Kyoto Drosophila Stock Center | 117012 | ATP sensor |
| UAS-Chk RNAi GD1829 | Vienna Drosophila Resource Center | v37139 | Chk RNAi line |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Glucose sensor |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Calcium sensor |
| UAS-Laconic | Sierralta Lab | – | Lactate sensor |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | – | CNRS-Paris |
| UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective | Olympus | – |
References
- Vergara, R. C., et al. The energy homeostasis principle: neuronal energy regulation drives local network dynamics generating behavior. Frontiers in Computational Neuroscience. 13 (49), 1-18 (2019).
- Pulido, C., Ryan, T. A. Synaptic vesicle pools are a major hidden resting metabolic burden of nerve terminals. Science Advances. 7 (49), 1-9 (2021).
- Benton, D., Parker, P. Y., Donohoe, R. T. The supply of glucose to the brain and cognitive functioning. Journal of Biosocial Science. 28 (4), 463-479 (1996).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Boumezbeur, F., et al. The contribution of blood lactate to brain energy metabolism in humans measured by dynamic 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy. The Journal of Neuroscience. 30 (42), 13983-13991 (2010).
- Baltan, S. Can lactate serve as an energy substrate for axons in good times and in bad, in sickness and in health. Metabolic Brain Disease. 30 (1), 25-30 (2015).
- Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilization in the brain. The Journal of Physiology. 596 (3), 347-350 (2018).
- Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2235-2246 (2018).
- Koveal, D., Diaz-Garcia, C. M., Yellen, G. Fluorescent biosensors for neuronal metabolism and the challenges of quantitation. Current Opinion in Neurobiology. 63, 111-121 (2020).
- Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15651-15656 (2009).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PloS One. 8 (2), 1-13 (2013).
- San Martin, A., et al. Imaging mitochondrial flux in single cells with a FRET sensor for pyruvate. PloS One. 9 (1), 1-9 (2014).
- Placais, P. Y., et al. Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Mann, K., Deny, S., Ganguli, S., Clandinin, T. R. Coupling of activity, metabolism and behaviour across the Drosophila brain. Nature. 593 (7858), 244-248 (2021).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106 (1), 55-64 (2018).
- Gonzalez-Gutierrez, A., Ibacache, A., Esparza, A., Barros, L. F., Sierralta, J. Neuronal lactate levels depend on glia-derived lactate during high brain activity in Drosophila. Glia. 68 (6), 1213-1227 (2020).
- Geistlinger, K., Schmidt, J. D. R., Beitz, E. Human monocarboxylate transporters accept and relay protons via the bound substrate for selectivity and activity at physiological pH. PNAS Nexus. 2 (2), 1-8 (2023).
- Pasco, M. Y., Leopold, P. High sugar-induced insulin resistance in Drosophila relies on the lipocalin Neural Lazarillo. PloS One. 7 (5), 1-8 (2012).
- McMullen, E., Weiler, A., Becker, H. M., Schirmeier, S. Plasticity of carbohydrate transport at the blood-brain barrier. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 1-15 (2020).
- Delgado, M. G., et al. Chaski, a novel Drosophila lactate/pyruvate transporter required in glia cells for survival under nutritional stress. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Stilwell, G. E., Saraswati, S., Littleton, J. T., Chouinard, S. W. Development of a Drosophila seizure model for in vivo high-throughput drug screening. European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2211-2222 (2006).
- Lerchundi, R., Huang, N., Rose, C. R. Quantitative imaging of changes in astrocytic and neuronal adenosine triphosphate using two different variants of Ateam. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14 (80), 1-13 (2020).
- Baeza-Lehnert, F., et al. Non-canonical control of neuronal Energy Status by the Na(+) Pump. Cell Metabolism. 29 (3), 668-680 (2019).
- Mattila, J., Hietakangas, V. Regulation of carbohydrate energy metabolism in Drosophilamelanogaster. Genetics. 207 (4), 1231-1253 (2017).
- De Backer, J., Grunwald, I. A role for glia in cellular and systemic metabolism: insights from the fly. Current Opinion in Insect Science. 53 (100947), 1-8 (2022).
- Loganathan, S., Ball, H., Manzo, E., Zarnescu, D. Measuring glucose uptake in Drosophila models of TDP-43 proteinopathy. Journal of Visualized Experiments. (174), e62936 (2021).
- Dienel, G., Rothman, D. L. In vivo calibration of genetically encoded metabolite biosensors must account for metabolite metabolism during calibration and cellular volume. Journal of Neurochemistry. , (2023).
- Gandara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation. Scientific Reports. 9, 1-11 (2019).
- Gandara, L., Durrieu, L., Wappner, P. Metabolic FRET sensors in intact organs: Applying spectral unmixing to acquire reliable signals. BioRxiv. , (2023).
