Visualización de monocarboxilatos y otros metabolitos relevantes en el cerebro de larvas de Drosophila ex vivo utilizando sensores codificados genéticamente
Summary
Aquí presentamos un protocolo para visualizar el transporte de monocarboxilatos, glucosa y ATP en células gliales y neuronas utilizando sensores basados en transferencia de energía por resonancia de Förster codificados genéticamente en una preparación cerebral larvaria de Drosophila ex-vivo .
Abstract
Los altos requerimientos energéticos de los cerebros debido a la actividad eléctrica son una de sus características más distintivas. Estos requisitos se satisfacen mediante la producción de ATP a partir de la glucosa y sus metabolitos, como los monocarboxilatos lactato y piruvato. Todavía no está claro cómo se regula este proceso o quiénes son los actores clave, particularmente en Drosophila.
Utilizando sensores basados en la transferencia de energía por resonancia de Förster codificados genéticamente, presentamos un método simple para medir el transporte de monocarboxilatos y glucosa en células gliales y neuronas en una preparación cerebral de larva de Drosophila ex vivo . El protocolo describe cómo diseccionar y adherir un cerebro larvario que expresa uno de los sensores a un cubreobjetos de vidrio.
Presentamos los resultados de un experimento completo en el que se midió el transporte de lactato en cerebros de larvas mediante la eliminación de transportadores de monocarboxilato previamente identificados en células gliales. Además, demostramos cómo aumentar rápidamente la actividad neuronal y rastrear los cambios en los metabolitos en el cerebro activo. El método descrito, que proporciona toda la información necesaria, puede utilizarse para analizar otros tejidos vivos de Drosophila .
Introduction
El cerebro tiene altos requerimientos de energía debido al alto costo de restaurar los gradientes iónicos en las neuronas causados por la generación y transmisión de señales eléctricas neuronales, así como la transmisión sináptica 1,2. Durante mucho tiempo se ha pensado que esta alta demanda de energía se satisface mediante la oxidación continua de la glucosa para producir ATP3. Transportadores específicos en la barrera hematoencefálica transfieren la glucosa de la sangre al cerebro. Los niveles glucémicos constantes aseguran que el cerebro reciba un suministro constantede glucosa. Curiosamente, la creciente evidencia experimental sugiere que las moléculas derivadas del metabolismo de la glucosa, como el lactato y el piruvato, juegan un papel importante en la producción de energía de las células cerebrales 5,6. Sin embargo, todavía existe cierto debate sobre la importancia de estas moléculas para la producción de energía y qué células del cerebro las producen o utilizan 7,8. La falta de herramientas moleculares apropiadas con la alta resolución temporal y espacial requerida para esta tarea es un problema importante que ha impedido que esta controversia se resuelva por completo.
El desarrollo y la aplicación de varios sensores metabólicos fluorescentes diseñados han dado lugar a un aumento notable en nuestra comprensión de dónde y cómo se producen y utilizan los metabolitos, así como de cómo se producen los flujos metabólicos durante la actividad basal y neuronalalta. Los sensores metabólicos codificados genéticamente basados en la microscopía de transferencia de energía por resonancia (FRET) de Förster, como ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (glucosa), Laconic (lactato) y Pyronic (piruvato), han contribuido a nuestra comprensión del metabolismo energético cerebral 10,11,12,13. Sin embargo, debido a los altos costos y al equipo sofisticado requerido para realizar experimentos en animales o tejidos vivos, los resultados en modelos de vertebrados todavía se limitan principalmente a cultivos celulares (células gliales y neuronas).
El uso emergente del modelo de Drosophila para expresar estos sensores ha revelado que las características metabólicas clave se conservan en todas las especies y su función se puede abordar fácilmente con esta herramienta. Más importante aún, el modelo de Drosophila ha arrojado luz sobre cómo la glucosa y el lactato/piruvato se transportan y metabolizan en el cerebro de la mosca, el vínculo entre el consumo de monocarboxilato y la formación de la memoria, y la notable demostración de cómo los aumentos en la actividad neuronal y el flujo metabólico se superponen 14,15,16,17. El método presentado aquí para medir los niveles de monocarboxilato, glucosa y ATP utilizando sensores FRET codificados genéticamente expresados en el cerebro de las larvas permite a los investigadores aprender más sobre cómo el cerebro de Drosophila utiliza la energía, que se puede aplicar a los cerebros de otros animales.
Demostramos que este método es eficaz para detectar lactato y glucosa en células gliales y neuronas, y que un transportador de monocarboxilato (Chaski) está implicado en la importación de lactato a las células gliales. También demostramos un método simple para estudiar los cambios en los metabolitos durante el aumento de la actividad neuronal, que se puede inducir fácilmente mediante la aplicación en baño de un antagonista del receptor GABAA . Finalmente, demostramos que esta metodología se puede utilizar para medir el transporte de monocarboxilato y glucosa en otros tejidos metabólicamente significativos, como los cuerpos grasos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso del modelo de Drosophila para el estudio del metabolismo cerebral es relativamente nuevo26, y se ha demostrado que comparte más características con el metabolismo de los mamíferos de lo esperado, que se ha estudiado principalmente in vitro en cultivos de neuronas primarias o cortes de cerebro. Drosophila sobresale en experimentos in vivo gracias a la batería de herramientas genéticas y sensores codificados genéticamente disponibles que permiten a lo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos los miembros del Laboratorio Sierralta. Este trabajo contó con el apoyo de FONDECYT-Iniciación 11200477 (a AGG) y FONDECYT Regular 1210586 (a JS). UAS-FLII12Pglu700μδ6 (sensor de glucosa) fue amablemente donado por Pierre-Yves Plaçais y Thomas Preat, CNRS-París.
Materials
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD Camera ORCA-R2 | Hamamatsu | – | |
| Cell-R Software | Olympus | – | |
| CG-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver |
| Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2-emission splitting system | Photometrics | – | |
| Glass coverslips (25 mm diameter) | Marienfeld | 111650 | Germany |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8,0,2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ software | National Institues of Health | Version 1,53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective | Olympus | – | |
| Methylparaben | Sigma | H5501 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Motor neuron driver | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675S | CAUTION-Fatal if swallowed |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Glial cell driver (all) |
| Sodium Lactate | Sigma | 71718 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI | Olympus | – | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Trehalose | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | Kyoto Drosophila Stock Center | 117012 | ATP sensor |
| UAS-Chk RNAi GD1829 | Vienna Drosophila Resource Center | v37139 | Chk RNAi line |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Glucose sensor |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Calcium sensor |
| UAS-Laconic | Sierralta Lab | – | Lactate sensor |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | – | CNRS-Paris |
| UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective | Olympus | – |
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