הדמיה של מונוקרבוקסילטים ומטבוליטים רלוונטיים אחרים במוח הזחל לשעבר Vivo Drosophila באמצעות חיישנים מקודדים גנטית
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לדמיין את ההובלה של מונוקרבוקסילטים, גלוקוז ו- ATP בתאי גלייה ונוירונים באמצעות חיישנים מבוססי העברת אנרגיה בתהודה Förster המקודדים גנטית בהכנת מוח זחל דרוזופילה ex-vivo .
Abstract
דרישות האנרגיה הגבוהות של המוח עקב פעילות חשמלית הן אחת התכונות הבולטות ביותר שלהם. דרישות אלה נפגשות על ידי ייצור ATP מגלוקוז ומטבוליטים שלו, כגון monocarboxylates לקטט ו pyruvate. עדיין לא ברור כיצד תהליך זה מוסדר או מי הם שחקני המפתח, במיוחד בדרוזופילה.
באמצעות חיישנים מבוססי העברת אנרגיה בתהודה Förster המקודדים גנטית, אנו מציגים שיטה פשוטה למדידת ההובלה של מונוקרבוקסילטים וגלוקוז בתאי גלייה ובתאי עצב בהכנת מוח זחל דרוזופילה ex-vivo . הפרוטוקול מתאר כיצד לנתח ולהצמיד מוח זחל המבטא את אחד החיישנים לכיסוי זכוכית.
אנו מציגים תוצאות של ניסוי שלם שבו העברת לקטט נמדדה במוחות של זחלים על ידי הפלת טרנספורטרים מונוקרבוקסילטים שזוהו בעבר בתאי גלייה. יתר על כן, אנו מדגימים כיצד להגביר במהירות את הפעילות העצבית ולעקוב אחר שינויים מטבוליטים במוח הפעיל. השיטה המתוארת, המספקת את כל המידע הדרוש, יכולה לשמש לניתוח רקמות חיות אחרות של דרוזופילה .
Introduction
למוח יש דרישות אנרגיה גבוהות בשל העלות הגבוהה של שחזור שיפועי יונים בנוירונים הנגרמים על ידי ייצור ושידור אותות חשמליים עצביים, כמו גם שידור סינפטי 1,2. דרישה גבוהה זו לאנרגיה נחשבת מזה זמן רב כמסופקת על ידי חמצון מתמשך של גלוקוז לייצור ATP3. טרנספורטרים ספציפיים במחסום הדם-מוח מעבירים את הגלוקוז בדם למוח. רמות גליקמיות קבועות מבטיחות שהמוח יקבל אספקה קבועה של גלוקוז4. באופן מעניין, עדויות ניסיוניות הולכות וגדלות מצביעות על כך שמולקולות שמקורן במטבוליזם של גלוקוז, כגון לקטט ופירובט, ממלאות תפקיד חשוב בייצור האנרגיה של תאי המוח 5,6. עם זאת, עדיין יש ויכוח על כמה חשובות מולקולות אלה לייצור אנרגיה ואילו תאים במוח מייצרים או משתמשים בהם 7,8. היעדר כלים מולקולריים מתאימים ברזולוציה הטמפורלית והמרחבית הגבוהה הנדרשת למשימה זו הוא נושא משמעותי שמנע ממחלוקת זו להיפתר לחלוטין.
הפיתוח והיישום של מספר חיישנים מטבוליים פלואורסצנטיים מהונדסים הביאו לעלייה יוצאת דופן בהבנה שלנו היכן וכיצד מטבוליטים מיוצרים ומשמשים אותם, כמו גם כיצד השטפים המטבוליים מתרחשים במהלך פעילות עצבית בסיסית וגבוהה9. חיישנים מטבוליים מקודדים גנטית המבוססים על מיקרוסקופ Förster resonance energy transfer (FRET), כגון ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (גלוקוז), לקוני (לקטט) ופירוני (פירובט), תרמו להבנתנו את חילוף החומרים של אנרגיית המוח 10,11,12,13. עם זאת, בשל העלויות הגבוהות והציוד המשוכלל הנדרש לביצוע ניסויים בבעלי חיים או ברקמות, התוצאות במודלים של בעלי חוליות עדיין מוגבלות בעיקר לתרביות תאים (תאי גלייה ונוירונים).
השימוש המתפתח במודל דרוזופילה כדי לבטא חיישנים אלה גילה כי תכונות מטבוליות מרכזיות נשמרות בין מינים שונים וניתן לטפל בתפקודם בקלות באמצעות כלי זה. חשוב מכך, מודל דרוזופילה שפך אור על האופן שבו גלוקוז ולקטט/פירובט מועברים ועוברים מטבוליזם במוח הזבוב, על הקשר בין צריכת מונוקרבוקסילט והיווצרות זיכרון, ועל ההדגמה המדהימה של האופן שבו עלייה בפעילות העצבית ובשטף המטבולי חופפים 14,15,16,17. השיטה המוצגת כאן למדידת רמות מונוקרבוקסילט, גלוקוז ו- ATP באמצעות חיישני FRET מקודדים גנטית המבוטאים במוח הזחל מאפשרת לחוקרים ללמוד יותר על האופן שבו המוח של דרוזופילה משתמש באנרגיה, אשר יכולה להיות מיושמת במוחות של בעלי חיים אחרים.
אנו מראים כי שיטה זו יעילה לאיתור לקטט וגלוקוז בתאי גלייה ובנוירונים, וכי טרנספורטר מונוקרבוקסילט (צ’אסקי) מעורב ביבוא לקטט לתאי גלייה. אנו גם מדגימים שיטה פשוטה לחקר שינויים מטבוליטים במהלך פעילות עצבית מוגברת, אשר ניתן לגרום בקלות על ידי יישום אמבטיה של אנטגוניסט קולטן GABAA . לבסוף, אנו מראים כי מתודולוגיה זו יכולה לשמש למדידת מונוקרבוקסילט והובלת גלוקוז ברקמות משמעותיות מטבולית אחרות, כגון גופי שומן.
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש במודל דרוזופילה לחקר חילוף החומרים במוח הוא חדש יחסית26, והוכח כי הוא חולק מאפיינים רבים יותר עם מטבוליזם של יונקים מהצפוי, אשר נחקר בעיקר במבחנה בתרביות נוירונים ראשוניות או בפרוסות מוח. דרוזופילה מצטיינת בניסויי in vivo הודות לסוללת הכלים הגנטיים והח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לכל חברי מעבדת Sierralta. עבודה זו נתמכה על ידי FONDECYT-Iniciación 11200477 (ל- AGG) ו- FONDECYT Regular 1210586 (ל- JS). UAS-FLII12Pglu700μδ6 (חיישן סוכר) נתרם באדיבות על ידי פייר-איב פלסאיס ותומס פראט, CNRS-פריז.
Materials
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD Camera ORCA-R2 | Hamamatsu | – | |
| Cell-R Software | Olympus | – | |
| CG-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver |
| Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2-emission splitting system | Photometrics | – | |
| Glass coverslips (25 mm diameter) | Marienfeld | 111650 | Germany |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8,0,2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ software | National Institues of Health | Version 1,53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective | Olympus | – | |
| Methylparaben | Sigma | H5501 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Motor neuron driver | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675S | CAUTION-Fatal if swallowed |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Glial cell driver (all) |
| Sodium Lactate | Sigma | 71718 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI | Olympus | – | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Trehalose | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | Kyoto Drosophila Stock Center | 117012 | ATP sensor |
| UAS-Chk RNAi GD1829 | Vienna Drosophila Resource Center | v37139 | Chk RNAi line |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Glucose sensor |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Calcium sensor |
| UAS-Laconic | Sierralta Lab | – | Lactate sensor |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | – | CNRS-Paris |
| UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective | Olympus | – |
References
- Vergara, R. C., et al. The energy homeostasis principle: neuronal energy regulation drives local network dynamics generating behavior. Frontiers in Computational Neuroscience. 13 (49), 1-18 (2019).
- Pulido, C., Ryan, T. A. Synaptic vesicle pools are a major hidden resting metabolic burden of nerve terminals. Science Advances. 7 (49), 1-9 (2021).
- Benton, D., Parker, P. Y., Donohoe, R. T. The supply of glucose to the brain and cognitive functioning. Journal of Biosocial Science. 28 (4), 463-479 (1996).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Boumezbeur, F., et al. The contribution of blood lactate to brain energy metabolism in humans measured by dynamic 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy. The Journal of Neuroscience. 30 (42), 13983-13991 (2010).
- Baltan, S. Can lactate serve as an energy substrate for axons in good times and in bad, in sickness and in health. Metabolic Brain Disease. 30 (1), 25-30 (2015).
- Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilization in the brain. The Journal of Physiology. 596 (3), 347-350 (2018).
- Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2235-2246 (2018).
- Koveal, D., Diaz-Garcia, C. M., Yellen, G. Fluorescent biosensors for neuronal metabolism and the challenges of quantitation. Current Opinion in Neurobiology. 63, 111-121 (2020).
- Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15651-15656 (2009).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PloS One. 8 (2), 1-13 (2013).
- San Martin, A., et al. Imaging mitochondrial flux in single cells with a FRET sensor for pyruvate. PloS One. 9 (1), 1-9 (2014).
- Placais, P. Y., et al. Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Mann, K., Deny, S., Ganguli, S., Clandinin, T. R. Coupling of activity, metabolism and behaviour across the Drosophila brain. Nature. 593 (7858), 244-248 (2021).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106 (1), 55-64 (2018).
- Gonzalez-Gutierrez, A., Ibacache, A., Esparza, A., Barros, L. F., Sierralta, J. Neuronal lactate levels depend on glia-derived lactate during high brain activity in Drosophila. Glia. 68 (6), 1213-1227 (2020).
- Geistlinger, K., Schmidt, J. D. R., Beitz, E. Human monocarboxylate transporters accept and relay protons via the bound substrate for selectivity and activity at physiological pH. PNAS Nexus. 2 (2), 1-8 (2023).
- Pasco, M. Y., Leopold, P. High sugar-induced insulin resistance in Drosophila relies on the lipocalin Neural Lazarillo. PloS One. 7 (5), 1-8 (2012).
- McMullen, E., Weiler, A., Becker, H. M., Schirmeier, S. Plasticity of carbohydrate transport at the blood-brain barrier. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 1-15 (2020).
- Delgado, M. G., et al. Chaski, a novel Drosophila lactate/pyruvate transporter required in glia cells for survival under nutritional stress. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Stilwell, G. E., Saraswati, S., Littleton, J. T., Chouinard, S. W. Development of a Drosophila seizure model for in vivo high-throughput drug screening. European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2211-2222 (2006).
- Lerchundi, R., Huang, N., Rose, C. R. Quantitative imaging of changes in astrocytic and neuronal adenosine triphosphate using two different variants of Ateam. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14 (80), 1-13 (2020).
- Baeza-Lehnert, F., et al. Non-canonical control of neuronal Energy Status by the Na(+) Pump. Cell Metabolism. 29 (3), 668-680 (2019).
- Mattila, J., Hietakangas, V. Regulation of carbohydrate energy metabolism in Drosophilamelanogaster. Genetics. 207 (4), 1231-1253 (2017).
- De Backer, J., Grunwald, I. A role for glia in cellular and systemic metabolism: insights from the fly. Current Opinion in Insect Science. 53 (100947), 1-8 (2022).
- Loganathan, S., Ball, H., Manzo, E., Zarnescu, D. Measuring glucose uptake in Drosophila models of TDP-43 proteinopathy. Journal of Visualized Experiments. (174), e62936 (2021).
- Dienel, G., Rothman, D. L. In vivo calibration of genetically encoded metabolite biosensors must account for metabolite metabolism during calibration and cellular volume. Journal of Neurochemistry. , (2023).
- Gandara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation. Scientific Reports. 9, 1-11 (2019).
- Gandara, L., Durrieu, L., Wappner, P. Metabolic FRET sensors in intact organs: Applying spectral unmixing to acquire reliable signals. BioRxiv. , (2023).
