تصور أحادي الكربوكسيل والمستقلبات الأخرى ذات الصلة في دماغ يرقات ذبابة الفاكهة خارج الجسم الحي باستخدام أجهزة استشعار مشفرة وراثيا
Summary
نقدم هنا بروتوكولا لتصور انتقال أحادي الكربوكسيل والجلوكوز و ATP في الخلايا الدبقية والخلايا العصبية باستخدام مستشعرات نقل طاقة الرنين Förster المشفرة وراثيا في تحضير دماغ يرقات ذبابة الفاكهة خارج الجسم الحي .
Abstract
تعد متطلبات الطاقة العالية للأدمغة بسبب النشاط الكهربائي واحدة من أكثر سماتها المميزة. يتم تلبية هذه المتطلبات من خلال إنتاج ATP من الجلوكوز ومستقلباته ، مثل أحادي الكربوكسيل اللاكتات والبيروفات. لا يزال من غير الواضح كيف يتم تنظيم هذه العملية أو من هم اللاعبون الرئيسيون ، لا سيما في ذبابة الفاكهة.
باستخدام مستشعرات نقل طاقة الرنين Förster المشفرة وراثيا ، نقدم طريقة بسيطة لقياس انتقال أحادي الكربوكسيلات والجلوكوز في الخلايا الدبقية والخلايا العصبية في تحضير يرقات ذبابة الفاكهة خارج الجسم الحي . يصف البروتوكول كيفية تشريح ولصق دماغ اليرقات الذي يعبر عن أحد المستشعرات إلى غطاء زجاجي.
نقدم نتائج تجربة كاملة تم فيها قياس نقل اللاكتات في أدمغة اليرقات عن طريق هدم ناقلات الكربوكسيل أحادية الكربوكسيل التي تم تحديدها سابقا في الخلايا الدبقية. علاوة على ذلك ، نوضح كيفية زيادة النشاط العصبي بسرعة وتتبع تغيرات الأيض في الدماغ النشط. يمكن استخدام الطريقة الموصوفة ، والتي توفر جميع المعلومات اللازمة ، لتحليل الأنسجة الحية الأخرى في ذبابة الفاكهة .
Introduction
الدماغ لديه متطلبات طاقة عالية بسبب التكلفة العالية لاستعادة التدرجات الأيونية في الخلايا العصبية الناتجة عن توليد الإشارات الكهربائية العصبية ونقلها ، وكذلك النقل المشبكي 1,2. يعتقد منذ فترة طويلة أن هذا الطلب المرتفع على الطاقة يتم تلبيته من خلال الأكسدة المستمرة للجلوكوز لإنتاج ATP3. تنقل ناقلات محددة عند الحاجز الدموي الدماغي الجلوكوز في الدم إلى الدماغ. تضمن مستويات نسبة السكر في الدم الثابتة أن يتلقى الدماغ إمدادات ثابتة من الجلوكوز4. ومن المثير للاهتمام ، أن الأدلة التجريبية المتزايدة تشير إلى أن الجزيئات المشتقة من استقلاب الجلوكوز ، مثل اللاكتات والبيروفات ، تلعب دورا مهما في إنتاج طاقة خلايا الدماغ 5,6. ومع ذلك ، لا يزال هناك بعض الجدل حول مدى أهمية هذه الجزيئات لإنتاج الطاقة والخلايا في الدماغ التي تنتجها أو تستخدمها 7,8. إن الافتقار إلى الأدوات الجزيئية المناسبة ذات الدقة الزمنية والمكانية العالية المطلوبة لهذه المهمة هو قضية مهمة حالت دون حل هذا الجدل تماما.
أدى تطوير وتطبيق العديد من أجهزة الاستشعار الأيضية الفلورية المهندسة إلى زيادة ملحوظة في فهمنا لمكان وكيفية إنتاج المستقلبات واستخدامها ، وكذلك كيفية حدوث التدفقات الأيضية أثناء النشاط العصبي القاعديوالعالي 9. ساهمت المستشعرات الأيضية المشفرة وراثيا القائمة على الفحص المجهري لنقل طاقة الرنين Förster (FRET) ، مثل ATeam (ATP) و FLII12Pglu700μδ6 (الجلوكوز) و Laconic (اللاكتات) و Pyronic (البيروفات) ، في فهمنا لعملية التمثيل الغذائي لطاقة الدماغ10،11،12،13. ومع ذلك ، نظرا لارتفاع التكاليف والمعدات المتطورة اللازمة لإجراء التجارب على أو الأنسجة الحية ، لا تزال النتائج في نماذج الفقاريات تقتصر في المقام الأول على مزارع الخلايا (الخلايا الدبقية والخلايا العصبية).
كشف الاستخدام الناشئ لنموذج ذبابة الفاكهة للتعبير عن هذه المستشعرات أن السمات الأيضية الرئيسية محفوظة عبر الأنواع ويمكن معالجة وظيفتها بسهولة باستخدام هذه الأداة. والأهم من ذلك ، أن نموذج ذبابة الفاكهة قد ألقى الضوء على كيفية نقل الجلوكوز واللاكتات / البيروفات واستقلابهما في دماغ الذبابة ، والعلاقة بين استهلاك أحادي الكربوكسيل وتكوين الذاكرة ، والعرض التوضيحي الرائع لكيفية تداخل الزيادات في النشاط العصبي والتدفق الأيضي14،15،16،17. الطريقة المعروضة هنا لقياس مستويات الكربوكسيل الأحادي والجلوكوز و ATP باستخدام مستشعرات FRET المشفرة وراثيا المعبر عنها في دماغ اليرقات تسمح للباحثين بمعرفة المزيد حول كيفية استخدام دماغ ذبابة الفاكهة للطاقة ، والتي يمكن تطبيقها على أدمغة الأخرى.
نظهر أن هذه الطريقة فعالة للكشف عن اللاكتات والجلوكوز في الخلايا الدبقية والخلايا العصبية ، وأن ناقل أحادي الكربوكسيلات (Chaski) يشارك في استيراد اللاكتات إلى الخلايا الدبقية. نوضح أيضا طريقة بسيطة لدراسة تغيرات الأيض أثناء زيادة النشاط العصبي ، والتي يمكن أن تحدث بسهولة عن طريق تطبيق حمام لمضادات مستقبلات GABAA . وأخيرا، نوضح أنه يمكن استخدام هذه المنهجية لقياس انتقال الكربوكسيل الأحادي والجلوكوز في الأنسجة الأخرى ذات الأهمية الأيضية، مثل الأجسام الدهنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد استخدام نموذج ذبابة الفاكهة لدراسة استقلاب الدماغ جديدا نسبيا26 ، وقد ثبت أنه يشترك في خصائص أكثر مع استقلاب الثدييات مما كان متوقعا ، والذي تمت دراسته بشكل أساسي في المختبر في مزارع الخلايا العصبية الأولية أو شرائح الدماغ. تتفوق ذبابة الفاكهة في التجارب ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جميع أعضاء مختبر سييرالتا. وحظي هذا العمل بدعم من 11200477 المؤسسة الوطنية للإحصاء (إلى AGG) و FONDECYT 1210586 العادية (إلى JS). تم التبرع ب UAS-FLII12Pglu700μδ6 (مستشعر الجلوكوز) من قبل بيير إيف بلاسايس وتوماس بريات ، CNRS-Paris.
Materials
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| CCD Camera ORCA-R2 | Hamamatsu | – | |
| Cell-R Software | Olympus | – | |
| CG-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver |
| Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| DV2-emission splitting system | Photometrics | – | |
| Glass coverslips (25 mm diameter) | Marienfeld | 111650 | Germany |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8,0,2 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| ImageJ software | National Institues of Health | Version 1,53t | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective | Olympus | – | |
| Methylparaben | Sigma | H5501 | |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Motor neuron driver | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675S | CAUTION-Fatal if swallowed |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Propionic Acid | Sigma | P1386 | |
| Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Glial cell driver (all) |
| Sodium Lactate | Sigma | 71718 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI | Olympus | – | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Trehalose | US Biological | T8270 | |
| UAS-AT1.03NL | Kyoto Drosophila Stock Center | 117012 | ATP sensor |
| UAS-Chk RNAi GD1829 | Vienna Drosophila Resource Center | v37139 | Chk RNAi line |
| UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Glucose sensor |
| UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Calcium sensor |
| UAS-Laconic | Sierralta Lab | – | Lactate sensor |
| UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | – | CNRS-Paris |
| UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective | Olympus | – |
References
- Vergara, R. C., et al. The energy homeostasis principle: neuronal energy regulation drives local network dynamics generating behavior. Frontiers in Computational Neuroscience. 13 (49), 1-18 (2019).
- Pulido, C., Ryan, T. A. Synaptic vesicle pools are a major hidden resting metabolic burden of nerve terminals. Science Advances. 7 (49), 1-9 (2021).
- Benton, D., Parker, P. Y., Donohoe, R. T. The supply of glucose to the brain and cognitive functioning. Journal of Biosocial Science. 28 (4), 463-479 (1996).
- Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
- Boumezbeur, F., et al. The contribution of blood lactate to brain energy metabolism in humans measured by dynamic 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy. The Journal of Neuroscience. 30 (42), 13983-13991 (2010).
- Baltan, S. Can lactate serve as an energy substrate for axons in good times and in bad, in sickness and in health. Metabolic Brain Disease. 30 (1), 25-30 (2015).
- Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilization in the brain. The Journal of Physiology. 596 (3), 347-350 (2018).
- Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2235-2246 (2018).
- Koveal, D., Diaz-Garcia, C. M., Yellen, G. Fluorescent biosensors for neuronal metabolism and the challenges of quantitation. Current Opinion in Neurobiology. 63, 111-121 (2020).
- Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15651-15656 (2009).
- Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PloS One. 8 (2), 1-13 (2013).
- San Martin, A., et al. Imaging mitochondrial flux in single cells with a FRET sensor for pyruvate. PloS One. 9 (1), 1-9 (2014).
- Placais, P. Y., et al. Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
- Mann, K., Deny, S., Ganguli, S., Clandinin, T. R. Coupling of activity, metabolism and behaviour across the Drosophila brain. Nature. 593 (7858), 244-248 (2021).
- Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106 (1), 55-64 (2018).
- Gonzalez-Gutierrez, A., Ibacache, A., Esparza, A., Barros, L. F., Sierralta, J. Neuronal lactate levels depend on glia-derived lactate during high brain activity in Drosophila. Glia. 68 (6), 1213-1227 (2020).
- Geistlinger, K., Schmidt, J. D. R., Beitz, E. Human monocarboxylate transporters accept and relay protons via the bound substrate for selectivity and activity at physiological pH. PNAS Nexus. 2 (2), 1-8 (2023).
- Pasco, M. Y., Leopold, P. High sugar-induced insulin resistance in Drosophila relies on the lipocalin Neural Lazarillo. PloS One. 7 (5), 1-8 (2012).
- McMullen, E., Weiler, A., Becker, H. M., Schirmeier, S. Plasticity of carbohydrate transport at the blood-brain barrier. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 1-15 (2020).
- Delgado, M. G., et al. Chaski, a novel Drosophila lactate/pyruvate transporter required in glia cells for survival under nutritional stress. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Stilwell, G. E., Saraswati, S., Littleton, J. T., Chouinard, S. W. Development of a Drosophila seizure model for in vivo high-throughput drug screening. European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2211-2222 (2006).
- Lerchundi, R., Huang, N., Rose, C. R. Quantitative imaging of changes in astrocytic and neuronal adenosine triphosphate using two different variants of Ateam. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14 (80), 1-13 (2020).
- Baeza-Lehnert, F., et al. Non-canonical control of neuronal Energy Status by the Na(+) Pump. Cell Metabolism. 29 (3), 668-680 (2019).
- Mattila, J., Hietakangas, V. Regulation of carbohydrate energy metabolism in Drosophilamelanogaster. Genetics. 207 (4), 1231-1253 (2017).
- De Backer, J., Grunwald, I. A role for glia in cellular and systemic metabolism: insights from the fly. Current Opinion in Insect Science. 53 (100947), 1-8 (2022).
- Loganathan, S., Ball, H., Manzo, E., Zarnescu, D. Measuring glucose uptake in Drosophila models of TDP-43 proteinopathy. Journal of Visualized Experiments. (174), e62936 (2021).
- Dienel, G., Rothman, D. L. In vivo calibration of genetically encoded metabolite biosensors must account for metabolite metabolism during calibration and cellular volume. Journal of Neurochemistry. , (2023).
- Gandara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation. Scientific Reports. 9, 1-11 (2019).
- Gandara, L., Durrieu, L., Wappner, P. Metabolic FRET sensors in intact organs: Applying spectral unmixing to acquire reliable signals. BioRxiv. , (2023).
