X선 결정학을 위한 지질 이중세포 환경에서의 ABCG5/G8 결정화

1. 클로닝과 단백질 발현 인간 ABCG5/G8 유전자를 이전 프로토콜25,26에 따라 Pichia pastoris 효모로 복제합니다. 간단히 말해서 pPICZB에서 pSGP18 및 pLIC 발현 벡터를 도출합니다. 리노바이러스 3C 프로테아제 부위를 암호화한 후 칼모듈린 결합 펩타이드(CBP)를 ABCG8 cDNA(pSGP18-G8-3C-CBP)의 C-말단에 추가합니다.글리신(His 6 GlyHis 6)으로 분리된6-히스티딘 태그를 ABCG5 cDNA(pLIC-G5-H12)의 C-말단에 첨가한다. electroporation을 사용하여 플라스미드를 Pichia 균주 KM71H로 동시 형질전환시킵니다.NOTE: 사용된 플라스미드, 배지 및 완충액에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 형질전환된 효모 세포를 28°C의 MD 한천 플레이트에서 성장시킵니다. 1-2일 후 10-12개의 콜로니를 선택하고 소규모 배양을 위해 50mL 원심분리 튜브를 사용하여 10mL의 최소 글리세롤 효모 질소 염기(MGY) 배지에 접종합니다.더 나은 통기를 위해 원심분리기 튜브 뚜껑에 세 개의 작은 구멍을 만듭니다. 600nm(OD600)의 광학 밀도가 10에 도달할 때까지 250rpm에서 지속적으로 흔들면서 세포가 28°C에서 성장하도록 하며, 일반적으로 1-2박이 걸립니다.참고: 세포 성장은 일반적으로 12-24시간이 걸립니다. 다음 날, 멸균 MGY 배지 1L를 2.4L 플라스크에 담아 1차 배양액과 함께 접종합니다. 플라스크를 28°C의 셰이커 인큐베이터에서 250rpm으로 24시간 동안 배양합니다.pH를 5-6 사이로 유지하려면 pH가 안정화될 때까지 10% 수산화암모늄(NH4OH)을 추가합니다. 배양 1L당 순수 메탄올 1mL(0.1%(v/v) 메탄올)을 첨가하여 pH를 조정하고 단백질 발현을 유도합니다.참고: 총 36-48시간 동안 12시간마다 리터 배양액당 5mL 순수 메탄올(0.5%(v/v) 메탄올)을 주입합니다. 4°C에서 30분 동안 15,000 x g 에서 원심분리하여 세포를 수확합니다. 세포 펠릿을 수집하고 0.5g/mL의 농도로 용해 완충액(0.33M 자당, 0.3M Tris-Cl pH 7.5, 0.1M 아미노헥사노산, 1mM EDTA 및 1mM EGTA)에 재현탁시킵니다. 현탁액을 -80 °C에서 보관하십시오. 일반적으로 배양된 세포 1L에서 30 ± 5g의 세포 질량을 회수할 수 있습니다.참고: 세포 펠릿을 냉동실에 직접 보관하거나 멤브레인 준비를 위해 용해 완충액에서 즉시 재현탁을 수행합니다. 2. 마이크로솜막의 제조 세포를 해동하고 단백질 분해 효소 억제제(2μg/mL 류펩틴, 2μg/mL 펩스타틴 A, 2mM PMSF, 재료 표 참조)를 추가합니다.세포를 추가로 용해하려면 25,000-30,000psi에서 얼음으로 냉각된 유화제 또는 미세유동화기( 재료 표 참조)를 사용하십시오. 이 과정을 3-4회 반복합니다. 세포 파편을 제거하기 위한 원심분리기: 3,500-4,000 x g 에서 15분 동안 회전한 다음 15,000 x g 에서 30분 동안 두 번째 회전. 두 스핀을 모두 4°C로 유지합니다. 마이크로솜막 소포를 분리하려면 상층액을 초원심분리 튜브로 옮기고 4°C에서 1.5시간 동안 2,00,000 x g 에서 초원심분리를 실시합니다.dounce 균질화기를 사용하여 50mL의 완충액 A(50mM Tris-Cl pH 8.0, 100mM NaCl 및 10% 글리세롤)에 멤브레인 펠릿을 재현탁시킵니다. 현탁액을 -80 °C에서 보관하십시오. 3. 단백질 준비 – 헤테로다이머의 정제 얼어붙은 마이크로솜막을 해동하고 가용화 완충액을 사용하여 농도를 4-6mg/mL로 조정합니다. 완충액은 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 100mM NaCl, 10% 글리세롤, 1%(w/v) β-도데실 말토시드(β-DDM), 0.5%(w/v) 콜레이트, 0.1%(w/v) 콜레스테릴 헤미숙시네이트(CHS), 5mM 이미다졸, 5mM β-메르캅토에탄올(β-ME), 2μg/mL 류펩틴, 2μg/mL 펩스타틴 A 및 2mM PMSF를 포함해야 합니다( 재료 표 참조).참고: 동일한 부피의 멤브레인 제제와 가용화 완충액을 혼합하거나 단백질 분해효소 억제제 및 환원제 없이 2배 가용화 완충액을 사용할 수 있습니다. 완충액을 짧게 끓이면 CHS를 효율적으로 용해시키는 데 도움이 됩니다. 정제 시에는 4°C 냉각 버퍼만 사용하십시오.혼합물을 4°C에서 1시간 동안 중간 속도로 저어줍니다. 실온(RT)에서 20-30분 동안 추가로 저어줍니다. 혼합물을 1,00,000 x g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리하여 불용성 멤브레인을 제거합니다. 가용화된 상층액을 수집하고 20mM 이미다졸 및 0.1mM TCEP를 첨가합니다. 친화성 컬럼 크로마토그래피26 수행: 가용화된 상층액을 버퍼 A(단계 2.2.1)에서 밤새 사전 평형화된 Ni-NTA 비드(10-15mL)( 재료 표 참조)에 결합합니다.참고: 이 시점부터 버퍼를 실행할 때 글리세롤을 사용하지 마십시오.25mM 이미다졸을 함유한 Buffer B(50mM HEPES, pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1%(w/v) β-DDM, 0.05%(w/v) cholate, 0.01%(w/v) CHS, 0.1mM TCEP)의 10컬럼 부피로 컬럼을 2회 세척합니다. 50mM 이미다졸을 함유한 10 컬럼 부피의 Buffer B로 컬럼을 세척합니다. 완충액 C(200mM 이미다졸이 포함된 완충액 B)를 사용하여 단백질을 용출합니다. 용리된 단백질에 1mM TCEP(재료 표 참조)와 10mM MgCl2를 추가합니다. SDS-PAGE 겔에서 용리된 분획을 검증하여 올바른 단백질 크기26을 확인합니다.참고: 일반적인 단백질 수율(1st Ni-NTA): 6L 배양액당 10-20mg의 단백질. 임계 미셀 농도 (CMC)의 10x 또는 5x (약 0.01 %)에서 DDM을 사용하십시오. 이 프로토콜은 0.1% DDM을 사용합니다. Ni-NTA 용리의 피크 분획을 동일한 부피의 완충액 D1(1mM CaCl 2, 1mM MgCl2의 완충액 B)으로 희석하고, 혼합하고, 단백질 분획을 CBP 세척 완충액 D1로 사전 평형을 이룬 CBP 컬럼(3-5mL)(재료 표 참조)에 로드합니다. 완충액 D1 및 D2(1mM CaCl2, 1mMMgCl2, 0.1%(w/v) 데실-말토스 네오펜틸 글리콜(DMNG)을 사용한 완충액 B, β-DDM 없음)을 사용하여 세제를 교환하기 위해 CBP 컬럼에서 순차 세척을 수행: 먼저 D1 컬럼 부피 3개로 세척합니다. 둘째, D1:D2(3:1, v/v)의 3컬럼 부피로 세척합니다. 셋째, D1:D2(1:1, v/v)의 3열 부피로 세척합니다. 네 번째 단계, D1:D2 컬럼 부피 3개(1:3, v/v)로 세척한 다음 D2 컬럼 부피 6-10개로 세척합니다. CBP 컬럼(총 10mL)에서 1mL 분획에 300mM NaCl이 포함된 CBP 세척 완충액 D2를 사용하여 단백질을 용리합니다. 용출된 분획을 1-2mL로 농축합니다.참고: 일반적인 단백질 수율(1st CBP)은 6L 배양액당 5-15mg의 단백질입니다. 말토스 네오펜틸 글리콜(MNG) 세제는 4°C에서 정제된 단백질 저장을 향상시킵니다. DMNG와 Lauryl MNG(LMNG)가 모두 사용되었으며, DMNG는 더 나은 X선 회절 결정을 산출했습니다. 임계 미셀 농도(CMC)의 10-20배인 약 0.003%에서 DMNG를 사용합니다. 이 프로토콜은 0.1% DMNG를 사용했습니다. CBP 용리액의 일부를 겔 여과 크로마토그래피(4.4단계)로 추가로 정제하여 단백질의 ATPase 활성을 분석하거나 투과 전자 현미경(TEM)을 통해 단분산성을 평가할 수 있습니다. 4. 단백질 준비 – 사전 결정화 처리 엔도글리코시다아제 H(Endo H, 10-15mg 정제 단백질당 ~0.2mg) 및 HRV-3C 프로테아제(10-15mg 정제 단백질당 ~2mg)를 각각 사용하여 N-결합 글라이칸 및 CBP 태그를 절단합니다( 재료 표 참조). 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. Endo H 및 3C 프로테아제 배양 중에 통합된 단백질에 대해 환원성 알킬화를 수행합니다. 4°C에서 밤새 20mM 요오도아세트아미드( 재료 표 참조)로 배양하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 얼음에 추가로 2mM 요오드아세트아미드를 넣고 1시간 배양합니다.참고: 이 단계는 4°C에서 최대 1개월 동안 단백질 저장을 더욱 안정화합니다. 두 번째 CBP 컬럼(1-2mL)을 사용하여 절단된 CBP 태그를 분리합니다. 이 프로세스에는 버퍼 D2를 사용합니다.참고: 일반적인 단백질 수율(2차 CBP)은 6L 배양액당 5-10mg의 단백질입니다. 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 CBP 태그가 없는 단백질을 정제합니다. 완충액은 10mM HEPES, pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1%(w/v) DMNG, 0.05%(w/v) 콜레이트 및 0.01%(w/v) CHS를 함유해야 합니다.참고: 일반적인 단백질 수율(겔 여과)은 6L 배양액당 2-8mg의 단백질입니다. 이 단계에서 겔 여과 중 DDM 피크(~65kD)가 없으면 DMNG로의 세제 교환이 성공했음을 나타냅니다. 환원성 메틸화를 통해 통합된 단백질 분획을 변형: 단백질에 20mM 디메틸아민 보란(DMAB, 재료 표 참조)과 40mM 포름알데히드를 추가합니다. 진동 쉐이커에서 4 °C에서 2 시간 동안 배양합니다. 10mM DMAB를 추가합니다.10mM DMAB의 첨가를 포함하여 4.5단계를 반복하고 4°C에서 밤새(12-18시간) 배양합니다. 100mM Tris-Cl, pH 7.5를 첨가하여 반응을 중단하십시오. 메틸화된 단백질을 100mM Tris-Cl, pH 8.0 및 100mM NaCl로 사전 평형화된 2mL Ni-NTA 컬럼에 로드합니다.10컬럼 용량의 세척 완충액(10mM HEPES, pH 7.5, 100mM NaCl, 0.5mg/mL DOPC: DOPE(3:1, w/w), 0.1%(w/v) DMNG, 0.05%(w/v) 콜레이트, 0.01%(w/v) CHS)를 사용하여 컬럼을 세척합니다. 용출 완충액(10mM HEPES, pH 7.5, 100mM NaCl, 200mM 이미다졸, 0.5mg/mL DOPC)을 사용하여 지질 단백질을 용리합니다. DOPE(1:1, w/w), 0.1%(w/v) DMNG, 0.05%(w/v) 콜레이트, 0.01%(w/v) CHS).참고: 일반적인 단백질 수율(2nd Ni-NTA)은 6L 배양액당 1-5mg의 단백질입니다. 4.4단계에서 사용된 완충액과 사전 평형을 이룬 PD-10 탈염 컬럼을 통해 단백질 용리액을 통과시킵니다. 탈염 및 지질 단백질을 콜레스테롤(이소프로판올 또는 에탄올로 제조)과 함께 밤새 ~20μM의 최종 농도로 배양합니다.다음날 아침, 4°C에서 10분 동안 1,50,000 x g 의 초원심분리에 의해 침전제를 제거한다. 상층액을 수집합니다. 100kDa 차단 원심 농축기를 사용하여 단백질을 30-50mg/mL의 최종 농도로 농축합니다. 탁상용 냉장 원심분리기를 사용하여 30°C에서 4분 동안 최고 속도로 침전제를 제거합니다. 상층액을 4°C의 얼음 위에 유지하고 이두박근에서 결정화 조건을 설정합니다.참고: 농축 단백질은 일주일 이내에 결정 성장을 위해 사용되어야 합니다. 단백질을 얼리지 마십시오. 5. bicelles에 있는 단백질 결정화 DMPC 지질과 CHAPSO 세제를 3:1(w/w) 비율로 사용하여 10% bicelle 원액을 준비합니다( 재료 표 참조).알림: 임계 미셀 농도(CMC)의 5배인 약 0.5%에서 CHAPSO를 사용하십시오. 이것은 단백질-bicelle 혼합물에서 CMC 주변의 세제 농도를 유지합니다(단계 5.2).탈이온화된 H2O-용해 세제(CHAPSO)를 사전 건조된 지질(5 mol% 콜레스테롤과 95 mol% DMPC의 혼합물)에 첨가합니다.알림: 클로로포름으로 다양한 지질 조성물을 준비하고 RT에서 질소 가스 스트림을 사용하여 유리 시험관에서 건조합니다. 잔류 용매를 진공 챔버에 밤새 넣어 얇은 지질층을 형성하여 제거합니다. 수조 초음파 발생기를 사용하여 지질과 세제를 재현탁시킵니다. 용액이 투명해질 때까지 지속적인 전력을 사용하여 얼음으로 식힌 물에 bicelle 혼합물을 초음파 처리합니다.알림: 청력 보호구를 사용하고 혼합물을 액상으로 유지하기 위해 충분한 얼음 공급을 확인하십시오. 0.2μm 원심 필터로 용해되지 않은 구성 요소를 제거합니다( 재료 표 참조).알림: 분취된 bicelle 용액을 -80°C에서 보관하십시오. 10% 이두(단계 5.1.4)와 단백질(단계 4.7.4)을 1:4(v/v) 비율로 부드럽게 결합하여 얼음 위에 단백질/이체 혼합물을 만들어 최종 단백질 농도가 5-10mg/mL 사이가 되도록 합니다. 단백질과 bicelle 혼합물을 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다. 48웰 플레이트를 사용하여 행잉 드롭 증기 확산 형식으로 결정화 조건을 설정합니다.1.6 M-2.0 M 황산암모늄, 100 mM MES(pH 6.5), 0%-4% PEG 400 및 1 mM TCEP를 포함하는 동일한 부피(0.5 또는 1 μL)의 단백질/바이셀 혼합물과 결정화 저장 용액을 혼합합니다( 재료 표 참조).알림: 각 실험 전에 저장 용액의 매트릭스를 만들고 황산암모늄(1.6-2.0M) 및 PEG 400(0%-4%)을 조정합니다. 20°C에서 결정화를 위해 배양합니다. 다음날 결정화 트레이를 점검하여 덮개 유리가 제대로 밀봉되었는지 확인하십시오. 적어도 하루에 한 번 결정 성장을 모니터링하십시오. 고품질 결정은 일반적으로 50-150 μm x 20-50 μm x 2-5 μm 크기의 1-2 주 이내에 나타납니다.참고: 결정은 낮은 단백질 농도에서 형성되는 데 더 오래 걸릴 수 있습니다. 성숙한 결정은 한 달 이내에 수확해야 합니다. 단백질 결정을 0.2M 말로네이트 나트륨에 담그고 50 또는 100 μm 극저온 루프를 사용하여 액체 질소에 급속 동결합니다.참고: X선 회절분석기를 사용할 수 있는 경우 15-30분 X선 빔 노출로 몇 개의 결정을 테스트하여 최대 5Å의 회절을 나타냅니다. 고분해능 회절에는 싱크로트론 광원이 필요합니다. 0.2M 말로네이트 나트륨을 동결 보호제로 사용하는 100μm x 50μm x 2μm 크기의 결정은 싱크로트론 X선으로 약 90개의 회절 이미지 프레임을 제공할 수 있습니다.