用于 X 射线晶体学的脂质双铈环境中的 ABCG5/G8 结晶

1. 克隆和蛋白表达 按照先前的方案将人ABCG5 / G8基因克隆到毕赤酵母中25,26。简而言之，从 pPICZB 衍生 pSGP18 和 pLIC 表达载体。添加编码鼻病毒 3C 蛋白酶位点的标签，然后添加钙调蛋白结合肽 （CBP） 到 ABCG8 cDNA （pSGP18-G8-3C-CBP） 的 C 末端。在ABCG5 cDNA的C端（pLIC-G5-H12）中加入一个由甘氨酸（His 6 GlyHis6）分离的六组氨酸标签。使用电穿孔将质粒共转化成毕赤酵母菌株KM71H。注：有关所用质粒、培养基和缓冲液的详细信息，请参阅 材料表 。 在28°C的MD琼脂平板上培养转化的酵母细胞。 1-2 天后，选择 10-12 个菌落，并使用 50 mL 离心管将它们接种到 10 mL 最小甘油酵母氮碱 （MGY） 培养基中进行小规模培养。在离心管盖上打三个小孔，以便更好地曝气。让细胞在28°C下生长，以250rpm不断摇动，直到600nm处的光密度（OD 600）达到10，通常需要1-2过夜。注意：细胞生长通常需要 12-24 小时。 第二天，取 1 L 无菌 MGY 培养基，并在 2.4 L 烧瓶中接种原代培养物。将烧瓶在28°C下以250rpm的振荡培养箱孵育24小时。为了将 pH 值保持在 5-6 之间，加入 10% 氢氧化铵 （NH4OH） 直到 pH 值稳定。 调节pH值，每1L培养物（0.1%（v/v）甲醇）中加入1mL纯甲醇，诱导蛋白表达。注：随后每 12 小时用 5 mL 纯甲醇每升培养物（0.5% （v/v） 甲醇）补料细胞，总持续时间为 36-48 小时。 通过在4°C下以15,000× g 离心30分钟来收获细胞。 收集细胞沉淀并将其重悬于裂解缓冲液（0.33M蔗糖，0.3M Tris-Cl pH 7.5,0.1M氨基己酸，1mM EDTA和1mM EGTA）中，浓度为0.5g / mL。将悬浮液储存在-80°C。 通常，可以从 1 L 培养的细胞中回收 30 ± 5 g 的细胞质量。注意：将细胞沉淀直接储存在冰箱中或立即在裂解缓冲液中进行重悬，用于膜制备。 2.微粒体膜的制备 解冻细胞并加入蛋白酶抑制剂（2μg/ mL亮肽素，2μg/ mL胃蛋白酶抑制素A，2mM PMSF，参见 材料表）。为了进一步裂解细胞，在25,000-30,000 psi下使用冰冷乳化剂或微流化器（参见 材料表）。重复此过程 3-4 次。 离心除去细胞碎片：以3,500-4,000×g旋转15分钟，然后以15,000×g再次旋转30分钟。将两个旋转保持在4°C。 为了分离微粒体膜囊泡，将上清液转移到超速离心管中，并在4°C下以2,00,000× g 超速离心1.5小时。使用dounce均质器将膜沉淀重悬于50mL缓冲液A（50mM Tris-Cl pH 8.0,100mM NaCl和10%甘油）中。将悬浮液储存在-80°C。 3. 蛋白质制备-异二聚体的纯化 解冻冷冻的微粒体膜，并使用增溶缓冲液将浓度调节至4-6mg / mL。缓冲液应含有 50 mM Tris-HCl、pH 8.0、100 mM NaCl、10% 甘油、1% （w/v） β-十二烷基麦芽糖苷 （β-DDM）、0.5% （w/v） 胆酸盐、0.1% （w/v） 胆固醇半琥珀酸酯 （CHS）、5 mM 咪唑、5 mM β-巯基乙醇 （β-ME）、2 μg/mL 亮肽素、2 μg/mL 胃蛋白酶抑制剂 A 和 2 mM PMSF（参见 材料表）。注：可以混合等体积的膜制剂和增溶缓冲液，或使用不含蛋白酶抑制剂和还原剂的 2x 增溶缓冲液。缓冲液的短暂沸腾有助于有效溶解CHS。纯化时，仅使用4°C冷却的缓冲液。在4°C下以中速搅拌混合物1小时。 随后在室温 （RT） 下额外搅拌 20-30 分钟。 将混合物在4°C下以1,00,000× g 离心30分钟以除去不溶性膜。收集溶解的上清液并加入20mM咪唑和0.1mM TCEP。 进行亲和柱层析26：将溶解的上清液与缓冲液A（步骤2.2.1）中的预平衡Ni-NTA珠（10-15mL）（参见 材料表）结合过夜。注意：从现在开始，避免在运行缓冲液中使用甘油。用含有25mM咪唑的10柱体积的缓冲液B（50 mM HEPES，pH 7.5,100 mM NaCl，0.1%（w/v）β-DDM，0.05%（w/v）胆酸盐，0.01%（w/v）CHS，0.1 mM TCEP）洗涤色谱柱两次。 用含有 50 mM 咪唑的 10 柱体积的缓冲液 B 洗涤色谱柱。 使用缓冲液 C（含 200 mM 咪唑的缓冲液 B）洗脱蛋白质。 向洗脱的蛋白质中加入 1 mM TCEP（参见 材料表）和 10 mM MgCl2 。 在SDS-PAGE凝胶上验证洗脱的馏分，以确认正确的蛋白质大小26。注：典型蛋白质产量（1st Ni-NTA）：每 6 L 培养物 10-20 mg 蛋白质。以 DDM 临界胶束浓度 （CMC） 的 10 倍或 5 倍（约 0.01%）使用 DDM。该协议采用 0.1% DDM。 用等体积的缓冲液D1（含1mM CaCl 2,1mM MgCl2的缓冲液B）稀释Ni-NTA洗脱的峰馏分，混合，并将蛋白质馏分上样到CBP柱（3-5mL）（参见材料表）上，该CBP柱已用CBP洗涤缓冲液D1预平衡。 使用缓冲液 D1 和 D2（缓冲液 B 含 1 mM CaCl 2、1 mM MgCl2、0.1% （w/v） 癸基-麦芽糖新戊二醇 （DMNG），不含 β-DDM）在 CBP 色谱柱上进行顺序洗涤以交换去污剂：首先，用 3 柱体积的 D1 洗涤;其次，用 3 柱体积的 D1：D2 （3：1， v/v） 洗涤;第三，用 3 柱体积的 D1：D2（1：1，v/v）洗涤;第四步，用 3 柱体积的 D1：D2 （1：3， v/v） 洗涤，然后用 6-10 柱体积的 D2 洗涤。 使用含有 300 mM NaCl 的 CBP 洗涤缓冲液 D2 从 CBP 柱（总 10 mL）中洗脱蛋白质，分 1 mL 分。将洗脱的馏分浓缩至 1-2 mL。注意：典型的蛋白质产量 （1st CBP） 为每 6 L 培养物 5-15 mg 蛋白质。麦芽糖新戊二醇（MNG）洗涤剂可增强纯化蛋白质在4°C下的储存。 同时使用DMNG和月桂基MNG（LMNG），DMNG产生更好的X射线衍射晶体。以临界胶束浓度 （CMC） 的 10-20 倍（约 0.003%）使用 DMNG。该协议使用0.1%DMNG。CBP洗脱液的一部分可以通过凝胶过滤色谱法（步骤4.4）进一步纯化，以分析蛋白质的ATP酶活性或通过透射电子显微镜（TEM）评估单分散性。 4. 蛋白质制备-预结晶处理 分别使用内切糖苷酶H（Endo H，每10-15mg纯化蛋白~0.2mg）和HRV-3C蛋白酶（每10-15mg纯化蛋白~2mg）切割N-连接聚糖和CBP标签（参见 材料表）。在4°C孵育过夜。 在Endo H和3C蛋白酶孵育期间，对混合的蛋白质进行还原烷基化。首先与20mM碘乙酰胺（参见 材料表）在4°C下孵育过夜。 随后在冰上用另外的2mM碘乙酰胺孵育1小时。注意：此步骤进一步将蛋白质储存在4°C下稳定长达一个月。 使用第二根 CBP 柱 （1-2 mL） 分离裂解的 CBP 标签。将缓冲区 D2 用于此过程。注意：典型的蛋白质产量 （2nd CBP） 为每 6 L 培养物 5-10 mg 蛋白质。 使用凝胶过滤色谱法纯化无 CBP 标签蛋白。缓冲液应含有 10 mM HEPES（pH 值 7.5）、100 mM NaCl、0.1% （w/v） DMNG、0.05% （w/v） 胆酸盐和 0.01% （w/v） CHS。注：典型的蛋白质产量（凝胶过滤）为每 6 L 培养物 2-8 mg 蛋白质。在此步骤中，凝胶过滤过程中没有DDM峰（~65 kD）表明洗涤剂与DMNG的交换成功。 通过还原甲基化修饰合并的蛋白质组分：向蛋白质中加入 20 mM 二甲胺硼烷（DMAB，参见 材料表）和 40 mM 甲醛。在振荡振荡器上在4°C孵育2小时。加入 10 mM DMAB。重复步骤4.5，包括加入10mM DMAB，并在4°C下孵育过夜（12-18小时）。 加入 100 mM Tris-Cl，pH 7.5 停止反应。 将甲基化蛋白加载到用 100 mM Tris-Cl、pH 8.0 和 100 mM NaCl 预平衡的 2 mL Ni-NTA 柱上。使用10柱体积的洗涤缓冲液（10mM HEPES，pH 7.5,100mM NaCl，含0.5mg / mL DOPC：DOPE（3：1，w/w），0.1%（w/v）DMNG，0.05%（w/v）胆酸盐，0.01%（w/v）CHS）洗涤色谱柱。 使用洗脱缓冲液（10 mM HEPES，pH 7.5,100 mM NaCl，200 mM 咪唑，0.5 mg / mL DOPC：DOPE（1：1，w/w），0.1%（w / v）DMNG，0.05%（w / v）胆酸盐，0.01%（w / v）CHS）洗脱重新解析的蛋白质。注：典型的蛋白质产量（2nd Ni-NTA）为每6 L培养物1-5 mg蛋白质。 将蛋白质洗脱液通过PD-10脱盐柱，该脱盐柱与步骤4.4中使用的缓冲液预先平衡。 将脱盐和重新定盐的蛋白质与胆固醇（在异丙醇或乙醇中制备）孵育过夜至终浓度~20μM。第二天早上，通过在4°C下以1,50,000× g 超速离心10分钟除去沉淀剂。 收集上清液。 使用 100 kDa 截止离心浓缩器将蛋白质浓缩至 30-50 mg/mL 的终浓度。 使用台式冷冻离心机在4°C下以最高速度除去沉淀物30分钟。 将上清液保持在4°C的冰上，并在双细胞中建立结晶条件。注意：浓缩的蛋白质应在一周内用于晶体生长。不要冷冻蛋白质。 5. 双细胞中的蛋白质结晶 用DMPC脂质和CHAPSO去污剂以3：1（w / w）的比例制备10%bicelle储备溶液（参见 材料表）。注意：在临界胶束浓度 （CMC） 的 5 倍下使用 CHAPSO，约为 0.5%。这保持了蛋白质-双歧杆菌混合物中其CMC周围的洗涤剂浓度（步骤5.2）。将去离子H2O溶解洗涤剂（CHAPSO）加入预干燥的脂质（5mol%胆固醇和95mol%DMPC的混合物）中。注意：在氯仿中制备各种脂质组合物，并在室温下使用氮气流在玻璃试管中干燥。 通过将它们置于真空室中过夜来消除残留溶剂，形成薄的脂质层。 使用水浴超声仪重悬脂质和洗涤剂。 使用连续电源在冰冷的水中超声处理 bicelle 混合物，直到溶液变得透明。注意： 使用听力保护装置并确保有足够的冰供应以将混合物保持在液相中。 用0.2μm离心过滤器除去未溶解的成分（参见 材料表）。注意：将等分的bicelle溶液储存在-80°C。 通过以 1：4 （v/v） 的比例轻轻混合 10% 双细胞（步骤 5.1.4）和蛋白质（步骤 4.7.4），在冰上形成蛋白质/双细胞混合物，使最终蛋白质浓度在 5-10 mg/mL 之间。 将蛋白质和双歧杆菌混合物在冰上孵育30分钟。 使用 48 孔板以悬挂液滴蒸气扩散形式设置结晶条件。混合等体积（0.5或1μL）的蛋白质/双歧管混合物和含有1.6M-2.0M硫酸铵，100mM MES（pH 6.5），0%-4%PEG 400和1mM TCEP的结晶储液（参见 材料表）。注意：在每次实验之前创建储层溶液的基质，调整硫酸铵（1.6-2.0 M）和PEG 400（0%-4%）。 在20°C孵育结晶。 第二天检查结晶托盘，以确保盖玻片密封正确。 每天至少监测一次晶体生长。高质量的晶体通常在 1-2 周内出现，尺寸为 50-150 μm x 20-50 μm x 2-5 μm。注意：在较低的蛋白质浓度下，晶体可能需要更长的时间才能形成。成熟的晶体应在一个月内收获。 将蛋白质晶体浸泡在0.2M丙二酸钠中，并使用50或100μm冷冻环在液氮中快速冷冻。注意： 如果有 X 射线衍射仪，请用 15-30 分钟的 X 射线束曝光测试一些晶体，以揭示高达 5 Å 的衍射。更高分辨率的衍射需要同步辐射光源。使用 0.2 M 丙二酸钠作为冷冻保护剂，尺寸为 100 μm x 50 μm x 2 μm 的晶体可以通过同步加速器 X 射线提供大约 90 个衍射图像帧。