脳血栓の細胞成分を包括的に解析する
Summary
この研究では、血栓の溶解、細胞染色、および定期的な血液検査による脳血栓の細胞成分分析のための迅速かつ効果的な方法について説明します。
Abstract
脳動脈や静脈に血栓ができる脳血栓症は、脳梗塞の最も一般的なタイプです。脳血栓の細胞成分の研究は、診断、治療、および予後にとって重要です。しかし、血栓の細胞成分を研究するための現在のアプローチは、主に in situ 染色に基づいており、細胞が血栓にしっかりと包まれているため、細胞成分の包括的な研究には適していません。これまでの研究では、 Sipunculus nudusから線溶酵素(sFE)を単離することに成功しており、架橋されたフィブリンを直接分解して細胞成分を放出することができます。本研究により、sFEに基づく脳血栓の細胞成分を網羅的に調べる方法を確立した。このプロトコルには、血栓溶解、細胞解放、細胞染色、および定期的な血液検査が含まれます。この方法によれば、細胞成分を定量的および定性的に研究することができる。この手法を用いた実験の代表的な結果を示す。
Introduction
脳血管疾患は、人間の健康を脅かす可能性のある3大疾患の1つであり、そのうち虚血性脳血管疾患は80%以上を占めています。脳血栓症と脳静脈血栓症は、主に脳血栓によって引き起こされる、今日最も懸念されている虚血性脳血管疾患です1,2。治療が適切に行われないと、障害率や死亡率が高くなり、退院後の再発率も高くなります3。
近年、脳血栓の細胞成分が脳血栓症の診断、治療、予後と密接な相関関係にあることを示す研究が増えています4,5,6。したがって、血栓組成、特に細胞成分に関するデータの可用性は、臨床診断と治療にとって重要です。残念ながら、現在利用可能な方法では、血栓成分を定量的にも定性的にも包括的に分析することはできません。例えば、Martius Scarlett Blueベースのin-situ染色では、血栓の特定のスライスの赤血球/白血球しか調べることができません7。免疫組織化学(IHC)に基づくin-situ染色では、抗体を用いて血栓の特定のスライスの限られた血液成分しか研究できません8。顕微鏡画像ベースの方法は、血栓9の特定の構造にのみ関係しています。さらに、これらの方法はすべて手間と時間がかかります10.現在まで、脳血栓細胞成分を定量的および定性的に研究するための手順は報告されていません。架橋されたフィブリンが血栓11内の血球をしっかりと包み込むことは広く認められている。したがって、架橋されたフィブリンの特異的な分解と無傷の細胞の放出は、細胞成分の正確な分析にとって重要です。
以前の研究では、シプンクルス・ヌーダス(sFE)から線溶酵素を単離し、フィブリンを特異的かつ迅速に分解することができます12。本明細書では、sFEの特異な活性に基づいて脳血栓の細胞成分を分析する方法が提案された。このプロトコルは血栓のフィブリンを最初に低下させるのにsFEを利用し、次にライトの汚損および定期的な血液検査13,14によって細胞部品を分析した。この方法によれば、脳血栓の細胞成分を定量的および定性的に研究することができる。このシンプルで効果的なプロトコルは、他の血栓の細胞成分分析にも適用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
sFEは、フィブリンを直接かつ効果的に分解することができる線溶剤である12,16。ここでは、sFEを用いて、脳血栓の架橋フィブリンを分解し、血栓内の封入細胞を遊離させ、血栓の細胞成分を定性的および定量的に分析しました。顕微鏡データと定期的な血液検査により、同封された細胞が血栓から放出されたことが示されました。さらに、放出され…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、厦門市科学技術局(3502Z20227197)と福建省科学技術局(No.2019J01070、No.2021Y0027)から資金提供を受けました。
Materials
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
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