Utilizzo della giunzione neuromuscolare larvale e delle cellule muscolari della Drosophila per visualizzare la rete di microtubuli
Summary
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per visualizzare le reti di microtubuli nelle giunzioni neuromuscolari e nelle cellule muscolari. In combinazione con i potenti strumenti genetici di Drosophila melanogaster, questo protocollo facilita notevolmente lo screening genetico e l’analisi della dinamica dei microtubuli per il ruolo delle proteine regolatrici della rete di microtubuli nel sistema nervoso.
Abstract
La rete di microtubuli è una componente essenziale del sistema nervoso. Le mutazioni in molte proteine regolatorie dei microtubuli sono associate a disturbi dello sviluppo neurologico e malattie neurologiche, come la proteina Tau associata ai microtubuli per le malattie neurodegenerative, la proteina di recisione dei microtubuli Spastin e Katanin 60 causano rispettivamente paraplegia spastica ereditaria e anomalie dello sviluppo neurologico. Il rilevamento di reti di microtubuli nei neuroni è vantaggioso per chiarire la patogenesi dei disturbi neurologici. Tuttavia, le piccole dimensioni dei neuroni e la disposizione densa dei fasci di microtubuli assonali rendono difficile la visualizzazione delle reti di microtubuli. In questo studio, descriviamo un metodo per la dissezione della giunzione neuromuscolare larvale e delle cellule muscolari, nonché l’immunocolorazione della α-tubulina e della proteina Futsch associata ai microtubuli per visualizzare le reti di microtubuli in Drosophila melanogaster. La giunzione neuromuscolare ci permette di osservare sia i microtubuli pre che post-sinaptici, e le grandi dimensioni delle cellule muscolari nella larva di Drosophila consentono una chiara visualizzazione della rete di microtubuli. Qui, mutando e sovraesprimendo la Katanina 60 in Drosophila melanogaster, e quindi esaminando le reti di microtubuli nella giunzione neuromuscolare e nelle cellule muscolari, riveliamo accuratamente il ruolo regolatore della Katanina 60 nel neurosviluppo. Pertanto, combinato con i potenti strumenti genetici di Drosophila melanogaster, questo protocollo facilita notevolmente lo screening genetico e l’analisi della dinamica dei microtubuli per il ruolo delle proteine regolatrici della rete di microtubuli nel sistema nervoso.
Introduction
I microtubuli (MT), come uno dei componenti strutturali del citoscheletro, svolgono un ruolo importante in diversi processi biologici, tra cui la divisione cellulare, la crescita e la motilità cellulare, il trasporto intracellulare e il mantenimento della forma cellulare. La dinamica e la funzione dei microtubuli sono modulate dalle interazioni con altre proteine, come MAP1, MAP2, Tau, Katanina e Kinesina 1,2,3,4,5.
Nei neuroni, i microtubuli sono essenziali per lo sviluppo e il mantenimento di assoni e dendriti. Le anomalie nei microtubuli portano a disfunzioni e persino alla morte dei neuroni. Ad esempio, nel cervello dei malati di Alzheimer, l’iperfosforilazione della proteina Tau riduce la stabilità della rete di microtubuli, causando irregolarità neurologiche6. Pertanto, l’esame delle reti di microtubuli contribuirà alla comprensione del neurosviluppo e della patogenesi delle malattie neurologiche.
La giunzione neuromuscolare (NMJ) è la sinapsi periferica formata tra un terminale dell’assone del motoneurone e una fibra muscolare, che è un eccellente e potente sistema modello per lo studio della struttura e delle funzioni sinaptiche7. Futsch è una proteina della Drosophila omologa alla proteina legante i microtubuli MAP1B presente nei mammiferi8. È espresso solo nei neuroni e svolge un ruolo nello sviluppo dei pulsanti sinaptici del NMJ 8,9. Nel wild-type, i fasci filamentosi che corrono lungo il centro dei processi NMJ sono visualizzati mediante immunocolorazione con anti-Futsch. Quando raggiunge l’estremità di NMJ, questo fascio ha la capacità di formare un anello costituito da microtubuli o di perdere la sua struttura filamentosa, risultando in un aspetto diffuso e punteggiato10. Le anse dei microtubuli sono associate a coni di crescita in pausa, il che suggerisce che l’array di microtubuli è stabile11. Pertanto, possiamo determinare indirettamente lo sviluppo stabile dei microtubuli nella NMJ mediante colorazione Futsch. Le grandi dimensioni delle cellule muscolari nella larva di Drosophila consentono una chiara visualizzazione della rete di microtubuli. I fattori che influenzano la stabilità della rete di microtubuli possono essere trovati analizzando la densità e la forma dei microtubuli. Allo stesso tempo, lo stato della rete di microtubuli delle cellule muscolari può essere verificato in modo incrociato con il risultato della NMJ per ottenere conclusioni più complete.
Molti protocolli sono stati impiegati per studiare la rete e la dinamica dei microtubuli. Tuttavia, queste ricerche si sono spesso concentrate su studi in vitro 12,13,14,15,16. In alternativa, alcuni esperimenti in vivo hanno impiegato la microscopia elettronica per rilevare il citoscheletro17. In base al legame specifico di anticorpi marcati con fluorescenza o coloranti chimici a proteine o DNA, i metodi qui presentati consentono di rilevare reti di microtubuli nella NMJ a livello di singoli neuroni in vivo, con risultati corroborati da osservazioni in cellule muscolari. Questo protocollo è semplice, stabile e ripetibile se combinato con i potenti strumenti genetici disponibili in Drosophila melanogaster, consentendo una vasta gamma di esami fenotipici e screening genetici per il ruolo delle proteine regolatorie della rete di microtubuli nel sistema nervoso in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui viene descritto un protocollo per la dissezione e l’immunocolorazione delle giunzioni neuromuscolari larvali e delle cellule muscolari della Drosophila . Ci sono diversi punti essenziali da considerare. In primo luogo, evitare lesioni ai muscoli osservati è fondamentale durante il processo di dissezione. Potrebbe valere la pena fissare il filetto prima di rimuovere gli organi interni per evitare il contatto diretto tra le pinze e i muscoli. Per evitare danni muscolari o la separazione dall’epidermide larval…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Ying Xiong per le discussioni e i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è sostenuto da una sovvenzione della National Science Foundation of China (NSFC) a C. M. (31500839).
Materials
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
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