שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לדמיין את רשתות microtubule בצמתים neuromuscular ותאי שריר. בשילוב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה של Drosophila melanogaster, פרוטוקול זה מקל מאוד על בדיקות גנטיות וניתוח דינמיקה של מיקרוטובולים עבור תפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים.
Abstract
רשת המיקרוטובולים היא מרכיב חיוני במערכת העצבים. מוטציות בחלבוני בקרה רבים של מיקרוטובולים קשורות להפרעות נוירו-התפתחותיות ולמחלות נוירולוגיות, כגון חלבון טאו הקשור למיקרוטובולים למחלות נוירודגנרטיביות, חלבון ניתוק מיקרוטובולים ספסטין וקטנין 60 גורמים לשיתוק ספסטי תורשתי ולהפרעות נוירו-התפתחותיות, בהתאמה. זיהוי רשתות מיקרוטובולים בנוירונים הוא יתרון להבהרת הפתוגנזה של הפרעות נוירולוגיות. עם זאת, הגודל הקטן של תאי עצב והסידור הצפוף של צרורות מיקרוטובולים אקסונליים הופכים את הדמיה של רשתות המיקרוטובולים למאתגרת. במחקר זה אנו מתארים שיטה לדיסקציה של הצומת העצבית-שרירית של הזחל ותאי שריר, כמו גם צביעה חיסונית של α-טובולין וחלבון Futsch הקשור למיקרוטובול כדי לדמיין רשתות מיקרוטובולים בדרוזופילה מלנוגסטר. הצומת העצבית-שרירית מאפשרת לנו לצפות הן במיקרוטובולים קדם-סינפטיים והן לאחר סינפטיים, והגודל הגדול של תאי שריר בזחל דרוזופילה מאפשר הדמיה ברורה של רשת המיקרוטובולים. כאן, על ידי מוטציה וביטוי יתר של קטנין 60 בדרוזופילה מלנוגסטר, ולאחר מכן בחינת רשתות המיקרוטובולים בצומת העצבית-שרירית ובתאי השריר, אנו חושפים במדויק את תפקיד הבקרה של קטנין 60 בהתפתחות עצבית. לכן, בשילוב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה של Drosophila melanogaster, פרוטוקול זה מקל מאוד על בדיקות גנטיות וניתוח דינמיקה של מיקרוטובולים עבור תפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים.
Introduction
מיקרוטובולים (MTs), כאחד המרכיבים המבניים של השלד הציטו-שלד, ממלאים תפקיד חשוב בתהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל חלוקת תאים, גדילה ותנועתיות של תאים, הובלה תוך-תאית ושמירה על צורת התא. דינמיקה ותפקוד של מיקרוטובולים מווסתים על ידי אינטראקציות עם חלבונים אחרים, כגון MAP1, MAP2, טאו, קטנין וקינסין 1,2,3,4,5.
בנוירונים, מיקרוטובולים חיוניים להתפתחות ותחזוקה של אקסונים ודנדריטים. הפרעות במיקרוטובולים מובילות לתפקוד לקוי ואפילו למוות של נוירונים. לדוגמה, במוחם של חולי אלצהיימר, זרחן יתר של חלבון טאו מפחית את יציבות רשת המיקרוטובולים, וגורם לאי סדירות נוירולוגית6. לפיכך, בחינת רשתות מיקרוטובולים תתרום להבנת ההתפתחות העצבית והפתוגנזה של מחלות נוירולוגיות.
הצומת העצבית-שרירית (NMJ) היא סינפסה היקפית הנוצרת בין מסוף אקסון נוירון מוטורי לבין סיב שריר, שהיא מערכת מודל מצוינת ורבת עוצמה לחקר המבנה והפונקציות הסינפטיות7. פוטש הוא חלבון בדרוזופילה שהוא הומולוגי לחלבון קושר המיקרוטובולים MAP1B שנמצא ביונקים8. הוא מתבטא רק בתאי עצב וממלא תפקיד בהתפתחות הכפתורים הסינפטיים 8,9 של NMJ. בצרורות נימה מסוג פראי שרצים לאורך מרכז תהליכי NMJ מדמיינים על ידי הכתמה חיסונית עם אנטי-פוטש. כאשר מגיעים לקצה של NMJ, צרור זה יש את היכולת או ליצור לולאה המורכבת microtubules או לאבד את המבנה נימה שלה, וכתוצאה מכך מראה מפוזר ניקוב10. לולאות מיקרוטובולים קשורות לקונוסי גדילה מושהים, מה שמרמז על כך שמערך המיקרוטובולים יציב11. לכן, אנו יכולים לקבוע בעקיפין את התפתחות המיקרוטובול היציב ב- NMJ על ידי צביעת פוטש. הגודל הגדול של תאי שריר בזחל דרוזופילה מאפשר הדמיה ברורה של רשת המיקרוטובול. הגורמים המשפיעים על יציבות רשת המיקרוטובולים ניתן למצוא על ידי ניתוח הצפיפות והצורה של מיקרוטובולים. במקביל, ניתן להצליב את מצב רשת המיקרוטובולים של תאי שריר עם התוצאה של NMJ כדי לקבל מסקנות מקיפות יותר.
פרוטוקולים רבים שימשו לחקר הרשת והדינמיקה של מיקרוטובולים. עם זאת, מחקרים אלה התמקדו לעתים קרובות במחקרי מבחנה 12,13,14,15,16. לחלופין, כמה ניסויים in vivo השתמשו במיקרוסקופ אלקטרונים כדי לזהות את שלד הציטו-שלד17. על פי הקישור הספציפי של נוגדנים המסומנים פלואורסצנטית או צבעים כימיים לחלבונים או לדנ”א, השיטות המוצגות כאן מאפשרות זיהוי של רשתות מיקרוטובולים ב- NMJ ברמה של נוירונים בודדים in vivo, עם תוצאות שאומתו על ידי תצפיות בתאי שריר. פרוטוקול זה הוא פשוט, יציב וניתן לחזרה כאשר הוא משולב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה הזמינים ב– Drosophila melanogaster, ומאפשר מגוון רחב של בדיקות פנוטיפיות ובדיקות גנטיות לתפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן מתואר פרוטוקול לדיסקציה וצביעה חיסונית של דרוזופילה , זחלים, צמתים עצביים-שריריים ותאי שריר. ישנן מספר נקודות חיוניות שיש לקחת בחשבון. ראשית, הימנעות מפגיעה בשרירים הנצפים היא חיונית במהלך תהליך הדיסקציה. ייתכן שכדאי לתקן את הפילה לפני הסרת איברים פנימיים כדי למנוע מגע ישיר בין ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר יינג שיונג על הדיונים וההערות על כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי מענק מהקרן הלאומית למדע של סין (NSFC) ל- C. M. (31500839).
Materials
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
References
- Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
- Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
- Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204 (2005).
- Roll-Mecak, A., McNally, F. J. Microtubule-severing enzymes. Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).
- Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. Microtubule-depolymerizing kinesins. Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).
- Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer’s disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
- Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
- Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
- Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
- Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
- Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
- Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).
- Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488 (2023).
- Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
- Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila Protocols. , (2000).
- Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
- Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
- Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202 (2011).
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
- Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).
