マイクロ流体と質量測光の結合によるマイクロモル濃度でのタンパク質複合体形成の解析

1. 機器の準備とソフトウェアの起動 質量光度計の電源を入れ、少なくとも1時間オンのままにしてから測定を開始してください。注意: これは、機器が一定の温度に達する必要があるためです。質量光度計を1時間オンにしたままにしないと、質量シフトが発生し、結果が不正確になる可能性があります。 電源を入れ、アイソレーションボタン(質量光度計の下)を押して、防振テーブルの電源を入れます。振動は質量測光装置の性能を制限するため、装置の感度を最大限に高めるには防振テーブルが重要です。マイクロ流体ボックスをオンにします。 データ収集ソフトウェアとマイクロ流体制御ソフトウェアを起動します。エアコンプレッサーをオンにします。 2. タンパク質サンプル、バッファー、洗浄液の調製 200 mLのPBS(pH 7.4)緩衝液を清潔な200 mLボトルに加え、200 mLのPBS(pH 5.0)緩衝液を2本目の200 mLボトルに加えます。注:200 mLボトルは、次のステップで「L」フローユニットセンサーに接続する必要があります。校正測定にはpH 7.4 PBS緩衝液を、サンプル測定にはpH 5.0 PBS緩衝液を使用してください。 0.5 mLの遠心チューブで、IgG(2 μM)とFcRn(20 μM)を1:10の比率で混合し、総容量を60 μLにします。FcRnとIgGのストック溶液は、それぞれ91.9μMと13.5μMです。9 μLのストックIgG + 13 μLのストックFcRn + 38 μLのPBS(pH 5.0、室温[RT])を遠心分離チューブ内で総容量60 μLに混合して反応液を調製します。2つの反応物の最終濃度は、IgGで2 μM、FcRnで20 μMでした。 別の0.5 mL遠心チューブで、20 μM濃度のβ-Amylaseキャリブラント20 μLを分注します。例として、ここで使用するβ-アミラーゼキャリブラントを準備するには、2.3.1.1-2.3.1.2で説明されている手順に従います。バイアル中の20 mgのβ-アミラーゼ粉末を、5.6 mg / mLに相当し、モル濃度100 μM(分子量56 kDa)の3.57 mLのPBS(5%グリセロール)に再懸濁します。. 20 μMに希釈するには、100 μMストックの200 μLと800 μLのPBS(pH 7.4、RT)を1 mLの遠心分離チューブに入れます。 サンプルをRTで少なくとも30分間インキュベートします。注:質量光度計の電源を入れた後、サンプルと校正希釈液の準備を開始します。この実験では、サンプルを120分間インキュベートしました。 3本の50 mL遠心分離チューブに、50 mLのPBS(pH 7.4)-洗浄液1(CS1)、50 mLの0.5 M NaOH-洗浄液2(CS2)、および50 mLの100%IPA-洗浄液3(CS3)を分注します。 3. 実験のセットアップ サンプルとキャリブラントをロードするには、キャリブラント遠心分離管をマイクロ流体ボックスの位置4に、サンプル遠心分離管を位置5に配置します(図1)。 洗浄液をロードするには、CS1、CS2、およびCS3をマイクロ流体ボックスの位置1、2、および3に配置します(図1)。注意: サンプル、キャリブラント、および洗浄液はマルチスイッチ(mスイッチ)に接続されています。Mスイッチは「S」フローユニットセンサーに接続されています。 バッファーラインに接続するキャップを200 mL(pH 7.4)バッファーボトルにねじ込みます。注意: バッファーラインは「L」フローユニットセンサーに接続されている遮断弁に接続されています。シャットオフバルブは、バッファフローが停止したときに発生する可能性のある吸い上げ効果を防ぎます。吸い上げると、バッファーリザーバーに戻る希釈された残留液からバッファーが汚染される可能性があります。 マイクロ流路チップを調製プレートに置きます。「S」フローユニットセンサーのもう一方のチューブ端を、マイクロ流体チップの最初のチャネルの「サンプルインレット」に押し込みます(図1)。横断抽出ラインが完成しました。 「L」フローユニットセンサーのもう一方のチューブ端を、マイクロ流体チップの最初のチャネルの「バッファーインレット」に押し込みます(図1)。バッファラインが完成しました。 流出を収集するには、マイクロ流体チップの最初のチャネルの「アウトレット」にチューブを押します。もう一方の端を、廃棄物を受け入れるフラスコまたはビーカーに排出するように配置します(図1)。 4. サンプルラインとバッファーラインをバッファーで下塗りします バッファーラインの手動遮断弁を開きます。 マイクロ流体制御ソフトウェアで、バッファラインの流量を1000μL/minに設定し、バッファラインの圧力が110mbarを超えないようにします(図2)。フローはバッファラインで自動的に開始されます(図1)。注意: バッファーラインの圧力が110mbarを超える場合は、フローセンサーを通過する空気が原因である可能性があります。圧力が数秒以内に正常に戻らない場合は、詰まりの可能性があります(通常は接続部でチューブが挟まれていることが原因)。その場合は、流れを止め、遮断弁から始まるバッファーラインの接続を確認してください。 マイクロ流体制御ソフトウェアで、mスイッチの位置1(PBSバッファーに対応)を選択し、サンプルラインの流量を8μL/minに設定し、サンプルラインの圧力が350mbarを超えないようにします。流れはサンプルラインで自動的に開始されます(図1)。 ピペットチップ(またはその他の軟質プラスチック部品)を使用して、チップに閉じ込められた気泡の近くから上から穏やかに圧力をかけ、気泡を取り除き、気泡が出口から確実に除去されるようにします。注意: 使用中のチャネルの「ミキサー」セクションと「観察エリア」(図1)セクションのすべての気泡を必ず取り除いてください。強く押しすぎるとチップが損傷する可能性があるため、注意してください。 5. マイクロ流体チップを質量光度計に載せ、焦点を合わせる 質量光度計の対物レンズに顕微鏡浸漬油を一滴垂らします。 マイクロ流体チップを「サンプルインレット」を上に向けて質量光度計のホルダーに置き、ステージクランプに取り付けたままにします(図1)。すべてのチューブ接続が接続されたままであることを確認してください。 データ収集ソフトウェアを使用してステージを移動し、チャンネル1の「観察領域」が対物レンズと揃っていることを確認します(図1)。 質量光度計の蓋を閉め、データ集録ソフトウェアの 液滴希釈検出フォーカス オプションを押します。 データ収集ソフトウェアの左下隅にある白いフォーカスリングを確認します(図3)。リングの隙間は、浸漬油に空気の泡が存在することを示しています。ステージ速度を最大まで上げ、ステージを横方向にゆっくりと動かすことで、これを取り除きます。 ピント合わせが完了したら、2〜3分待ってから最初の録音を行います。次に、 Record を押して1分間の測定値を記録し、(測定値を観察して)不純物が現れないことを確認します。注意: 不純物はガラス表面または緩衝液中に存在する可能性があります。データ収集ソフトウェアのシャープネス値は4.5%を超える必要があります。 6. 質量測光キャリブレーション マイクロ流体制御ソフトウェアで、mスイッチを位置4(校正器に対応)に切り替え、サンプルラインの流量が8μL/minに設定され、サンプルラインの圧力が350mbarを超えないようにします(図2)。キャリブラントはチップを通る流れを開始します。約1.5〜2.5分待ちます(または、データ収集ソフトウェアでキャリブラントが一貫して表示されるまで)。時間は、サンプルラインのチューブの長さによって異なる場合があります。 キャリブラントが一貫して確認されたら(つまり、正確な質量測光測定に十分なイベント数)、マイクロ流体制御ソフトウェアで、流量をこの実験の目標希釈レベルである0.5μL/minに減らします。注:流量を高くすると、キャリブラントがチップに到達するのに必要な時間が短縮されます。 測定面に着地する分子が「少なすぎない」または「多すぎない」ことを確認してください(図4)。着地イベント密度が「理想的」でない場合は(図4)、マイクロ流体制御ソフトウェアで流量を変更します。イベント密度が低すぎる場合は、十分に分離されたランディングイベントが観察されるまでサンプル流量を上げます(ただし、8 μL/分を超えないようにしてください)。高すぎる場合は、サンプル流量を下げてください(ただし、0.1μL/minを下回らないようにしてください)。 サンプルチューブ内のキャリブラント容量が少なくなっている場合は、空気が注入されないように、mスイッチの位置をPBS pH 7.4ライン(位置1)に変更します。 [記録]を押して、60秒測定します。選択したフォルダにファイルを保存します。メモ: データ集録ソフトウェアは、拡張子が.mpのファイルを生成します。 7. サンプルラインのクリーニングと流れの停止 マイクロ流体制御ソフトウェアで、mスイッチの位置2に切り替え、サンプル圧力を800 mbarに変更します(図2)。CS2(NaOH)でシステムを4分間フラッシュします。 mスイッチの位置3に切り替え、CS3(IPA)でシステムを4分間フラッシュします。 mスイッチの位置1に切り替え、CS1(PBS)でシステムを4分間フラッシュします。 マイクロ流体制御ソフトウェアで、サンプルラインとバッファーラインの圧力を0に設定してすべての流れを停止し、バッファーバルブを停止します。 切りくずをステージから外し、準備プレートに戻します。すべてのチューブを外し、サンプルチューブの端を廃液ボトルに入れます。イソプロパノールとワイプで対物レンズを洗浄します。 8. 質量測光サンプルの測定 200 mL(pH 7.4)緩衝液ボトルに接続されたキャップを緩め、200 mL(pH 5.0)緩衝液ボトルにねじ込みます。 手順3.4〜5.6を繰り返しますが、チップの最初のチャネルではなく2番目のチャネルを使用します。 マイクロ流体制御ソフトウェアで、mスイッチを位置5(サンプルに対応)に切り替え、サンプルラインの流量を8μL/minに設定し、サンプルラインの圧力が350mbarを超えないようにします(図2)。 手順6.2〜6.4を繰り返して、サンプルを測定します。使用する流量を計算するには、流量の倍率差が目的のサンプル希釈係数と一致していることを確認してください。たとえば、ここで2000倍の希釈を達成するには、流量は2000倍異なります。バッファー流量は1000μL/min、サンプル流量は0.5μL/minです。実験の最後には、クリーニング手順に従って、常にラインを清潔に保ちます。 9. データ分析 データの取得が終了したら、データ解析ソフトウェアを起動します(図5)。 左上のプラス(+)アイコンをクリックし、.mpキャリブラントファイルを選択します。ソフトウェアは、ロードされたファイルの分析を開始します。サイズと測定回数によっては、数分かかる場合がありますデータ集録ソフトウェアでデータを取得している間は、データ解析ソフトウェアで.mpファイルを解析すると、データの品質が低下する可能性があるため、解析しないでください。 Create mass calibration ボタン(右下)を押します。ダイアログが開き、フィットしたピークのコントラスト値が入力された表が表示されます。 値を近似ピークの既知の質量値に変更し(β-アミラーゼの場合、これらの値は56 kDa、112 kDa、および224 kDaです)、 Saveを押します。新しく作成されたキャリブレーションファイル(拡張子.mc)が [Mass Calibration ]パネル(データ解析ソフトウェアの左下)に表示されます(図6)。 左上のプラス(+)アイコンをクリックし、.mp サンプルファイルを選択します。 図 5 に示すように、質量ヒストグラムを作成するには、[解析] タブに移動し、[ヒストグラム] モードと [質量プロット] オプションを選択します。必要に応じて、ビンの幅、質量制限、およびその他のパラメーターを調整します。 必要に応じて、図をエクスポートしたり、ワークスペース全体を.dmpファイルとして保存したりする前に、 図 タブでプロットをさらにカスタマイズします。