يعمل التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) كنموذج حيواني للتصلب المتعدد. توضح هذه المقالة طريقة لتسجيل التهاب الحبل الشوكي وإزالة الميالين وإصابة المحور العصبي في EAE. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم طريقة لتحديد مستويات ضوء الخيوط العصبية القابلة للذوبان في مصل الفئران ، مما يسهل تقييم إصابة المحور العصبي في الفئران الحية.
التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج شائع قائم على المناعة للتصلب المتعدد (MS). يمكن أن يحدث هذا المرض في القوارض عن طريق التحصين النشط بمكونات البروتين في غمد المايلين ومساعد فرويند الكامل (CFA) أو عن طريق نقل الخلايا التائية المستجيبة الخاصة بالمايلين من القوارض المحضرة ببروتين المايلين / CFA إلى القوارض الساذجة. عادة ما يتم تسجيل شدة EAE على مقياس سريري مكون من 5 نقاط يقيس درجة الشلل الصاعد ، ولكن هذا المقياس ليس مثاليا لتقييم مدى التعافي من EAE. على سبيل المثال ، تظل الدرجات السريرية مرتفعة في بعض نماذج EAE (على سبيل المثال ، نموذج البروتين السكري قليل التغصن المايلين [MOG] الناجم عن الببتيد من EAE) على الرغم من حل الالتهاب. وبالتالي ، من المهم استكمال التسجيل السريري بالتسجيل النسيجي ل EAE ، والذي يوفر أيضا وسيلة لدراسة الآليات الأساسية للإصابة الخلوية في الجهاز العصبي المركزي (CNS).
هنا ، يتم تقديم بروتوكول بسيط لإعداد وتلوين الحبل الشوكي وأقسام الدماغ من الفئران وتسجيل الالتهاب وإزالة الميالين وإصابة المحور العصبي في الحبل الشوكي. يمكن أيضا تطبيق طريقة تسجيل تسلل الكريات البيض في الحبل الشوكي لتسجيل التهاب الدماغ في EAE. كما تم وصف بروتوكول لقياس ضوء الشعيرات العصبية القابلة للذوبان (sNF-L) في مصل الفئران باستخدام مقايسة الجزيئات الصغيرة (SIMOA) ، والتي توفر ملاحظات حول مدى إصابة الجهاز العصبي المركزي بشكل عام في الفئران الحية.
التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج الفئران الأكثر شيوعا لمرض إزالة الميالين البشري ، التصلب المتعدد (MS) 1. علم الأمراض الالتهابية الكلاسيكي لمرض التصلب العصبي المتعدد ، بما في ذلك تسلل IFN-γ (جاما) والخلايا التائية المساعدة المنتجة ل IL-172 ، وتسلل الخلايا الوحيدة الالتهابية3 ، وتشكيل آفات مزيل الميالين الالتهابية حول الأوعية الدموية وشبه السحائية4 ، وحدوث إصابة محورية4 في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، لوحظ أيضا في EAE5،6،7،8،9. جعل التشابه في آليات المناعة بين EAE و MS EAE نموذجا مناسبا قبل السريري لاختبار فعالية وآليات عمل عدد من العلاجات المعتمدة على المناعة لمرض التصلب العصبي المتعدد ، بما في ذلك ناتاليزوماب ، فينجوليمود ، ثنائي ميثيل فومارات ، وخلات جلاتيرامر (تمت مراجعته في1،5). تقوم بعض أنظمة EAE بنمذجة جوانب أخرى من أمراض التصلب العصبي المتعدد التدريجي بخلاف الإصابة المحورية ، بما في ذلك تطور الالتهاب السحائي الفرعي في الدماغ ، وإزالة الميالين المزمن ، وضمور الحبل الشوكي ، والمشبك ، وفقدان الخلايا العصبية6،10،11،12. وبالتالي ، فإن EAE له فائدة لفحص فعالية العلاجات الوقائية العصبية لمرض التصلب العصبي المتعدد.
يتم تحفيز EAE في القوارض بعدة طرق. التحصين النشط هو طريقة الحث الأكثر شيوعا ويتضمن تحصين القوارض بمستضدات المايلين (إما البروتينات الكاملة أو الببتيدات) المستحلبة في CFA المكملة بالمتفطرة السلية المقتولة بالحرارة 13. اعتمادا على سلالة الفأر ، يتم إعطاء سم السعال الديكي (PTX) أيضا في اليوم 0 واليوم 2 من التحصين لزيادة تغلغل المرض13. يمكن أيضا تحفيز EAE عن طريق نقل الخلايا التائية الخاصة بالمايلين التي تم الحصول عليها من الفئران المحضرة بالمايلين / CFA إلى الفئران السليمة14 أو يمكن أن تتطور تلقائيا في الفئران التي تفرط في التعبير عن مستقبلات الخلايا التائية المحددة لمستضدات المايلين الرئيسية5.
عادة ما يتم تسجيل شدة مرض EAE وتطوره باستخدام مقياس سريري منفصل من 5 نقاط: 1 – عرج الذيل ، 2 – ضعف الأطراف الخلفية أو القدم ، 3 – الشلل التام في أحد الأطراف الخلفية أو كليهما ، 4 – ضعف الأطراف الأمامية ، 5 – المحتضرين أو الميتين13. نظام التسجيل السريري هذا سليم في توثيق تطور الشلل الصاعد الذي يحدث في بداية المرض ولكنه أقل حساسية في التقاط مدى الشفاء من الهجمات الالتهابية للجهاز العصبي المركزي. على سبيل المثال ، يتم تعيين درجة 2 على مقياس EAE لكل من الفئران التي تتنقل بصعوبة والفئران التي تتنقل بسهولة ولكنها تظهر ضعفا في الإمساك بالقدم. يمكن أن تظل الدرجات عالية في مرحلة ما بعد الحادة من EAE بسبب وجود إصابة أو فقدان محور عصبي دائم ، على الرغم من حل الاستجابة الالتهابية9. كانت هناك مجموعة متنوعة من المحاولات لتطوير أنظمة تسجيل أكثر دقة ، واختبارات سلوكية ، ومقاييس الأطراف الخلفية وقوة القبضة ، وأنظمة مراقبة الأشعة تحت الحمراء لالتقاط الاختلافات في العجز السريري بشكل أفضل في EAE9،16،17،18 ؛ ومع ذلك ، فإن مقاييس التسجيل الأكثر تعقيدا هذه لا تميز مساهمة الالتهاب مقابل إصابة الأنسجة في العجز العصبي الأساسي. وبالتالي ، فإن النهج القياسي الذهبي لتسجيل شدة EAE هو إجراء كل من التسجيل السريري والنسيجي.
هنا ، يتم وصف بروتوكول لكيفية تشريح وتضمين الحبل الشوكي للفأر وعينات الدماغ في البارافين بطريقة تلتقط العملية العشوائية لتشكيل الآفة التي تحدث في EAE. يتم تقديم بروتوكول أيضا حول كيفية تلطيخ الأقسام باستخدام Luxol fast blue (LFB) ، الذي تم إنشاؤه في الأصل بواسطة Kluver و Barrera19 ، والذي يكتشف المايلين في الجهاز العصبي المركزي. المقاطع إما ملطخة ب LFB وحده (لتحليل إزالة الميالين) أو ملطخة بالهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) للمساعدة في تصور الآفات الالتهابية وتسجيلها. يتم توفير بروتوكولات أيضا لتحديد وجود الكريات البيض الكلية (CD45) ، وفقدان المايلين ، وعدد المحاور المصابة (SMI-32) في الحبل الشوكي باستخدام الأجسام المضادة المتاحة تجاريا ، وتقنيات الكيمياء المناعية (IHC) ، والبرامج المتاحة للجمهور. يمكن أيضا تطبيق البروتوكول المستخدم لتحديد كريات الدم البيضاء في الحبل الشوكي لتحديد كريات الدم البيضاء في الدماغ.
التقييم النسيجي لفقدان المحور العصبي والإصابة في الدماغ أكثر صعوبة نسبيا منه في الحبل الشوكي لأن مساحات المادة البيضاء في الدماغ لا تعمل بالتوازي مع بعضها البعض. ظهر قياس ضوء الخيوط العصبية في المصل (sNF-L) كعلامة حيوية واعدة لإصابة الخلايا العصبية في MS20,21. وقد وسعت الدراسات الحديثة هذه التكنولوجيا إلىEAE 22،23،24. هنا ، يتم تقديم طريقة لقياس ضوء الخيوط العصبية في الدم (sNF-L) في الفئران الحية باستخدام مقايسة الجزيئات الصغيرة (SIMOA). لا تتطلب هذه الطريقة سوى كمية صغيرة من المصل ويمكن إجراؤها على الفئران الحية في نصف يوم فقط ، مما يوفر ملاحظات سريعة حول كيفية تأثير العلاج المختبر على إصابة الجهاز العصبي المركزي بشكل عام. يمكن تطبيق جميع الطرق الموضحة هنا على الفئران من أي جنس أو سلالة.
يعد التلوين النسيجي للحبل الشوكي أداة مهمة في تقييم شدة مرض EAE ، لا سيما في الحالات التي توجد فيها اختلافات بين مجموعات العلاج في مدى الشفاء من المرض في مرحلة ما بعد الحادة من المرض. يساعد تلطيخ تسلل الخلايا المناعية (CD45) والمايلين (LFB) وإصابة المحور العصبي (SMI-32) على توصيف السبب الكامن وراء تغيير الدرجات السريرية في الفئران. يوفر بروتوكول التلوين النسيجي الموصوف هنا منظورا للالتهاب بالإضافة إلى مدى إصابة المايلين والمحور العصبي. علاوة على ذلك ، فإن النتائج الموضحة تثبت صحة قياس sNF-L كطريقة لتقييم مدى الضرر العصبي الكلي في EAE.
تتمثل المعلمات الحاسمة لهذا التحليل في التأكد من أن الباحثين أعمى عن هوية الأقسام وأن هناك عينات مكافئة في كل مستوى من مستويات الحبل الشوكي عبر الفئران المختلفة. وذلك لأن شدة الالتهاب يمكن أن تكون أكبر في المستويات المنخفضة من الحبل السري. معلمة مهمة أخرى هي حجم المجموعات التجريبية. عادة ما يتم حصاد الحبل الشوكي والأدمغة من 6-8 فئران لكل مجموعة عند نقطة النهاية لرؤية اختلافات كبيرة بين المجموعات ذات العلاجات أو الأنماط الجينية ذات أحجام التأثير المتواضعة. من المهم أيضا التأكد من أن الفئران المختارة ، عند حساب متوسطها ، لديها درجات متوسطة تمثيلية للمجموعة بأكملها. فيما يتعلق باستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، فإن المشكلة الشائعة التي يواجهها أولئك الذين يفتقرون إلى الخبرة في البروتوكول هي أن الحبل الشوكي ثابت لفترة زمنية غير كافية ولا يمكن بثقه بسهولة من العمود الفقري. إذا كانت هذه هي الحالة ، يمكن تشريح الحبل الشوكي يدويا من العمود عن طريق القص على طول العمليات الشائكة باستخدام مقص دقيق وفتح العمود للكشف عن الحبل الشوكي. بدلا من ذلك ، يمكن إصلاح الأنسجة لبضعة أيام إضافية دون التدخل في نجاح تلطيخ الأجسام المضادة. استنساخ الأجسام المضادة الموصوفة هنا تعمل في الأنسجة الثابتة تصل إلى 2 أسابيع في الفورمالين.
يتطلب تضمين قطع الحبل الشوكي مهارة وممارسة. يوصى بارتداء عدسات العين وتوجيه مصباح فوق محطة التضمين لتصور أفضل لما إذا كانت الأقسام تسقط في المقطع العرضي أو في المقطع الطولي. إن الحفاظ على أطوال قطع الحبل الشوكي عند أقل من 2 مم أثناء الكسب سيساعدها على السقوط في المقطع العرضي. هناك مشكلة شائعة أخرى يواجهها المستخدمون الأقل خبرة وهي أن LFB يتبخر أثناء الحضانة الليلية ، تاركا نصف الشريحة ملطخة والنصف الآخر غير ملوث. لتجنب التبخر ، يجب إغلاق طبق تلطيخ الزجاج بغشاء لدن بالحرارة ثم غلاف بلاستيكي. في حالة حدوث التبخر وكانت المقاطع ملطخة بشكل غير متساو ، يوصى بإزالة اللون الأزرق تماما من الشرائح بكربونات الليثيوم وإعادة تلطيخها مرة أخرى في LFB طوال الليل. هناك مشكلة شائعة أخرى وهي أن المستخدمين لا يقومون بإزالة اللون الأزرق تماما من المادة الرمادية بعد LFB. من الأهمية بمكان فحص الأقسام الفردية تحت المجهر للتأكد من الوصول إلى قدر كاف من إزالة اللون الأزرق قبل الشروع في الخطوات الأخرى في البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن بقع CD45 و SMI-32 IHC تعمل بقوة ، إلا أنه لا يزال من المهم استكشاف تركيزات الأجسام المضادة وإصلاحها في التجارب الأولية لكل دفعة جديدة من الأجسام المضادة يتم تلقيها. يمكن القيام بذلك عن طريق اختبار مجموعة متنوعة من تركيزات الجسم المضاد في قسم التحكم الإيجابي (الحبل الشوكي EAE). يجب أن يتضمن التلوين لأول مرة أيضا تحكما سلبيا يتكون من جسم مضاد ثانوي وحده دون إضافة جسم مضاد أولي. أخيرا ، من الأهمية بمكان في تحليل الصور عتبة الصور الفردية لأن التلوين يمكن أن يكون غير متساو عبر الشرائح أو الأقسام.
يستخدم هذا البروتوكول البرامج المتاحة مجانا. إذا لم يكن لدى المرء إمكانية الوصول إلى معالج أو مضمن أو ميكروتوم ، فيمكن الحصول على هذه الخطوات إلى نواة علم الأمراض في المستشفى التي تقدم هذه الخدمات. أيضا ، إذا لم يكن لدى المرء إمكانية الوصول إلى ماسح الشرائح ، فيمكن للمرء استخدام مجهر ضوئي مزود بكاميرا فيديو لحفظ صور TIFF للحبل الشوكي أو مناطق الدماغ. لسير العمل القائم على المجهر ، التقط أقسام LFB أو LFB / H&E بطاقة منخفضة (تكبير 40x) ولتلوين CD45 و SMI-32 ، تخيل أربع نوافذ على الأقل متمركزة في الأجزاء البطنية والظهرية والجانبية من الحبل الشوكي (تكبير 200x ل CD45 وتكبير 400x ل SMI-32). يمكن إجراء تحليل الصور على هذه الصور لتحديد التلوين بطريقة مماثلة كما هو موضح.
يعتمد قرار النهج النسيجي الذي يجب اتباعه لتسجيل EAE على مدى اختلاف الدرجات السريرية بين المجموعات. على سبيل المثال ، إذا كانت هناك اختلافات جذرية في النتيجة السريرية EAE (حصلت مجموعة واحدة على EAE والأخرى لم تحصل عليها) ، فإن هذا يتعلق عادة بالاختلافات في الالتهاب المحيطي. في هذه الحالة ، يكون تسجيل وجود آفات مزيل للميالين على الأقسام الملطخة ب LFB / H &E كافيا وسيكشف عن الاختلافات بين المجموعات. إذا كانت المجموعات أكثر تشابها في النتيجة السريرية في البداية وكانت هناك اختلافات بدلا من ذلك في مدى الشفاء السريري (مثل التجربة في الشكل 5 أ) ، فمن الأفضل تطبيق سير العمل النسيجي الكامل الموضح هنا ، بما في ذلك تسجيل التهاب الدماغ في جذع الدماغ والمخيخ ، لتمييز ما إذا كانت الاختلافات المزمنة للمرض تتعلق بالاختلافات في الالتهاب أو تلف الأنسجة. إذا تم العثور على اختلافات في الالتهاب كما تم تقييمها من خلال حساب CD45 ، فيمكن إجراء المزيد من دراسات IHC لتلطيخ الخلايا التائية (المضادة ل CD3) ، وتسلل الخلايا الوحيدة / الضامة (Mac3) والدبقية الصغيرة (Iba-1 / TMEM119) (مستنسخات الأجسام المضادة الموصى بها موجودة في الجدول التكميلي 3). ينعكس تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال زيادة شدة تلطيخ Iba-1 على الخلايا الدبقية الصغيرة Iba-1 + TMEM-19 + ذات العلامات المزدوجة وزيادة تراجع عمليات الخلايا الدبقية الصغيرة التي يمكن تقييمها من خلال تحليل Sholl في الأقسام32. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق تقنيات مثل قياس التدفق الخلوي أو تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لإجراء توصيف أعمق لتواتر ونمط ظاهري مجموعات المناعة في الدماغ والحبل الشوكي.
يعد عد محاور SMI-32 + طريقة حساسة للكشف عن إصابة المحور العصبي في EAE32,33 وفي MS34. SMI-32 ، الذي يكتشف الشكل غير المفسفر من الخيوط العصبية الثقيلة أو المتوسطة يتراكم في المصابيح النهائية للخلايا العصبية المعبرة. بديل للكشف عن المحاور المصابة هو تلطيخ ببروتين السلائف الأميلويد (APP) الذي يمكن أن يتراكم في المحاور نتيجة لتعطل نقل المحورالعصبي 33. نمط تلطيخ SMI-32 و APP على الرغم من أن كلاهما يعكس إصابة محور عصبي ، إلا أنهما لا يتداخلان عادة ، مما يشير إلى أنهما يكتشفان أمراضا مختلفة33. يمكن للمرء أيضا استكمال المقاييس النسيجية لإصابة المحور العصبي عن طريق قياس sNF-L ، وهو مقياس سريع وحساس للإصابة المحورية المستمرة في كل من الحبل الشوكي والدماغ. يوفر ميزة أنه يمكن القيام به في نصف يوم في الفئران الحية. عيب هذه الطريقة هو أن المجموعات باهظة الثمن والآلة متخصصة للغاية. تقدم الشركة التي تبيع مجموعة sNF-L رسوما مقابل الخدمة لأولئك الذين ليس لديهم إمكانية الوصول إلى جهاز SIMOA. بديل لتقييم إصابة المحور العصبي هو تسجيل فقدان المحور إما عن طريق حساب المحاور العصبية في الأجزاء الملطخة باللون الأزرق من التولويدين من الحبل الشوكي12 أو حساب حزم الخيوط العصبية المكتشفة بواسطة SMI-31 في مناطق المادة البيضاء للحبل الشوكي32. كلاهما نهج أكثر شاقة من قياس SMI-32 أو sNF-L.
إذا اختلفت الدرجات السريرية ل EAE بين المجموعات ، ولكن تسجيل الالتهاب وإزالة الميالين وإصابة المحور العصبي لا يكشف عن الاختلافات بين المجموعات ، فقد يكون من المفيد تلطيخ تنشيط الخلايا النجمية باستخدام GFAP (انظر الجدول التكميلي 3 لاستنساخ الأجسام المضادة الموصى به). يرتبط تنشيط الخلايا النجمية بزيادة تلطيخ GFAP وقد ثبت أن هذا يرتبط بتقدم EAE في بعض نماذج EAE بما في ذلك EAE المزمن في DArat 35.
في الختام ، يصف هذا البروتوكول الطرق ويوفر سير عمل تحليلي لإجراء التسجيل النسيجي ل EAE.
The authors have nothing to disclose.
نشكر الدكتور ريموند سوبل (جامعة ستانفورد) على إظهار طريقته في تحقيق وإصلاح أقسام الدماغ والحبل الشوكي. نشكر كايل روبرتون وميلان جانجولي من مركز تورنتو لعلم الظواهر لتعلم طريقة التضمين وقطع العديد من أقسام الدماغ والحبل الشوكي. نشكر الدكتور ماثيو كوسيك والدكتور روبرت فوجينامي (جامعة يوتا) على مشاركة بروتوكولاتهما لتسجيل الالتهاب تحت السحائي وحول الأوعية الدموية في الحبل الشوكي. نشكر شالينا عثمان على مشاركة استنساخ الجسم المضاد CD45. نشكر Xiofang Lu على التدريب على معالج الأنسجة ومحطة تضمين الأنسجة وصيانة هذه المعدات في مركز أبحاث كينان للبحوث الطبية الحيوية في مستشفى سانت مايكل. تم دعم هذا العمل من خلال منحة طبية حيوية من MS Canada (إلى SED). يتم دعم كارمن أوتشيفيري من قبل منحة دراسية من حكومة كندا. يتم دعم نوريا ألفاريز سانشيز من قبل زمالة كينان لما بعد الدكتوراه.
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Used to fix spinal cord and brain specimens |
1000 mL Glass Beaker | Pyrex | 1000 | |
15 mL Falcon Tube | Starstedt | 62.554.100 | Fixing and storing spinal cord and brain |
250 mL Erlenmeyer Flask | Pyrex | 4980 | |
500 mL Glass Beaker | Pyrex | 1003 | |
92 mm x 16 mm Petri Dishes | Starstedt | 82-1473-001 | Used in the tissue grossing procedure |
95% Ethyl Alcohol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Dehydration and rehydration steps |
ABC Elite Kit | Vector Labratories | PK6100 | Used for immunohistochemistry labeling |
Aqua Hold 2 PAP Pen | Cole Parmer | UZ-75955-53 | Used for drawing around tissue sections in Immunohistochemical Staining |
Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector Labratories | SP-2001 | |
Biosafety Cabinet | Any | ||
Biotinylated rabbit anti-rat IgG | Vector Labratories | BA-4000 | Used for CD45 staining |
C57BL6/J Mice | Jackson Laboratory | Stock # 664 | These mice were used in experiments shown in paper. |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST Plus | |
CitriSolv | Fisher Scientific | 04-355-121 | Used for de-waxing. Is an alternative to xylene |
DAB Kit | Vector Labratories | SK-4100 | Used for developing in immunohistochemistry |
ddH2O | – | – | |
Disposable Scalpel | Magna | M92-10 | Used for grossing spinal cord and brain |
DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining dish | Cole Parmer | UZ-48585-60 | Used for histochemical staining and washes |
DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining rack | Cole Parmer | 10061392 | Used for immunohistochemistry and histochemistry |
Eosin Y | Bioshop | 173772-87-1 | Stains cytoplasm |
Feather Microtome Blades | Fisher Scientific | 12-634-1C | Used for sectioning paraffin |
Filter Paper | Whatman | 1001110 | Used to filter the formalin (during grossing) and the luxol fast blue |
Fine Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14160-10 | Used to snip brain and the skull |
Fumehood | Any | ||
Gibco DPBS | Fisher Scientific | 14190944 | |
Glacial Acetic Acid | BioShop | ACE333.4 | Used in the luxol fast blue staining procedure |
Histoplex Histology Containers | Starplex Scientific | 565-060-26 | Fixing spinal cord and brain |
Hydrogen Peroxide | Fisher Chemicals | H325-500 | Used to remove endogenous peroxidase in the tissue |
ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark Professional | 34155 | Used for immunohistochemistry |
Lens paper | VWR | 52846-001 | Used for trapping spinal cord species in cassette during processing |
Light microscope | Any | ||
Lithium carbonate | Sigma Aldrich | 554-13-3 | De-blueing after luxol fast blue staining |
Luxol blue | Sigma Aldrich | 1328-51-4 | Stains CNS myelin |
M.O.M Immunodetection Kit | Vector Labratories | BMK-2202 | Used to stain SMI-32 |
Methanol | Fisher Chemicals | A454.2 | Used for fixation |
Mayer's Hematoxylin | Electron Microscopy Sciences | 26381-02 | Stains nuclei |
Micro-Adson Forceps with Teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | Used for reflecting the skull during dissections |
Microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
Microvette Capillary Tubes CB 300 Z | Starstedt | 16.440.100 | Used for blood collection |
Micrscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545A | Used for coverslipping |
Mini Shaker | VWR | 12620-938 | Used for making buffers |
NF light kit | Quanterix | 103186 | This kit can be used for detection of mouse or human soluble neurofilament in serum |
Nitrile Gloves | VWR | 76307-462 | Safety |
Normal Goat Serum | Vector Labratories | S-1000 | Blocking reagent |
Normal Rabbit Serum | Vector Labratories | S-5000 | Blocking reagent |
OmniSette Tissue Cassettes | Fisher Scientific | M4935FS | Used for embedding spinal cord and brain |
p1000 Pipette and Tips | various | ||
p200 Pipette and Tips | various | ||
Paraffin Embedding station | Leica Biosystems | Model EG1160 | |
Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Medium | Leica Biosystems | 39601006 | Used for embedding spinal cord and brain |
Permount Mounting Medium | Fisher Chemicals | SP15-100 | Used for mounting coverslips on slides |
pH meter | Fisher Scientific | 13636AB315B | Used for pHing buffers |
Plastic Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | Used for pHing buffers |
Potassium Chloride | BioShop | 7447-40-7 | Used for making PBS |
Potassium Phosphate Monobasic | BioShop | 7778-77-0 | Used for making PBS |
Pressure Cooker | Nordic Ware | Tender Cooker | |
Purified rat anti-mouse CD45 | Vector Labratories | 553076 | Detects leukocytes |
Reagent grade alcohol 100% | VWR | 89370-084 | Dehydration and rehydration steps |
Reagent grade alcohol 70% | VWR | 64-17-5 | Dehydration and rehydration steps |
Rotary Microtome | Leica Biosystems | Model RM2235 | |
Simoa Machine | Quanterix | HD-X | |
Slide Scanner | Zeiss | AxioScan.Z1 | |
SMI-32 mouse IgG1 antibody | Biolegend | 801701 | Detects damaged axons |
Sodium Chloride | BioShop | 7647-14-5 | Used for making PBS |
Sodium Phosphate Dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | Used for making PBS |
Standard Adson Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | Used for dissection steps |
Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Used to collect sections |
Surgical Tough Cuts | Fine Science Tools | 14110-15 | Used to cut through the spine, body wall, and skin |
Tissue Processor | Leica Biosystems | Model TP1020 | |
Tri-soldium citrate | Thermo Fisher Scientific | 03-04-6132 | Used for antigen retrieval |
Tween-20 | BioBasic | 9005-64-5 | Used for washing sections |
X-P Pierce XP-100 plate seal | Excel Scientific | 12-140 | Used for the sNF-L Assay |
Xylene | Fisher Chemicals | 1330-20-7 | Used for de-waxing and clearing sections |
Funnel | Cole Parmer | RK-63100-64 | Used to filter formalin before grossing tissue |
Stir Plate | Any | Used to make solutions | |
Oven | Any | Used to bake tissue sections after cutting | |
Parafilm | Bemis | 13-374-10 | Used to seal LFB staining dish |
Microwave | Any | Timing may vary depending on the microwave model | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Used to make blocking buffer |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408–129 | Used to store mouse serum samples |
Vortex | Any | Used to prepare samples for sNF-L assay | |
Waterbath | Any | Used to warm enzyme substrate for sNF-L assay |