Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

Tüm EAE deneyleri, 10-12 haftalıkken dişi C57BL/6J farelerde indüklendi ve yerel yetkililer (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen) tarafından onaylandı. Deneylerin herhangi bir zamanında Alman ve AB hayvan koruma yasasına uygunluk da sağlandı. Tüm fareler ayrı ayrı havalandırılan kafes hayvan barınağı koşullarında tutuldu. NOT: Aşağıdaki reaktif hacimleri, aşağıda CNS hücre süspansiyonu olarak adlandırılan ve yaklaşık 20 mg ila 500 mg ağırlığında olan bir yetişkin murin beyni ve omuriliğini ifade eder. Birden fazla CNS hücre süspansiyonunun ayrışması planlanıyorsa, tüm reaktif hacimleri ve malzemeleri buna göre ölçeklendirilmelidir. Dulbecco’nun fosfat tamponlu salininin (D-PBS; 1x) kalsiyum ve magnezyum içeren, 1 g/L glikoz ve 36 mg/L sodyum piruvat ile desteklenmiş) tüm deney boyunca sürekli olarak buz üzerinde saklanması önerilir. Hücre ekimi daha sonra planlanıyorsa, tüm adımları steril koşullar altında davlumbaz kullanarak gerçekleştirin. Aksi takdirde, aşağıdaki protokol bölümlerinden hiçbirinin bir başlık altında gerçekleştirilmesi gerekmez. Tamponları buz üzerinde saklayın. Yalnızca önceden soğutulmuş çözeltiler kullanın ve tüm deney boyunca girdap oluşmasını önleyin. Genel iş akışı için Şekil 1’e bakın. Şekil 1: Naif ve EAE farelerde oligodendrositlerin, mikrogliaların, astrositlerin ve nöronların eşzamanlı izolasyonu için iş akışı. İş akışının ilk adımları hem saf hem de EAE fareler için aynıdır. Bir EAE kopyası ile çalışmak isteniyorsa, EAE indüksiyonu önceden yapılmalıdır (1). Protokol kısaca, murin beyni ve omuriliğinin diseksiyonu (2) ve ayrışması (3) ile başlar, ardından enkaz (4) ve kırmızı kan hücrelerinin (5) çıkarılması ile devam eder. Daha sonra, elde edilen saflaştırılmış CNS hücre süspansiyonu, oligodendrositlerin ve mikroglia’nın MACS yoluyla eşzamanlı izolasyonu için iki fraksiyona bölünür (6). Mikroglia, anti-CD11b mikro boncuklar aracılığıyla tespit edilirken, oligodendrositler anti-O4 mikro boncuklar (pozitif seçimler) kullanılarak izole edilir. Oligodendrositlerin (8) negatif akışından astrositler, anti-ACSA-2 mikro boncukları (pozitif seçim) ve nöronlar, biyotin etiketlemesi ve tüm nöronal olmayan hücrelerin tükenmesi (negatif seçim) yoluyla izole edilir. EAE farelerinde, CD11b+ hücrelerinin izolasyonunu, makrofajlar, dendritik hücreler, monositler, granülositler ve EAE seyri sırasında nöroinflamasyon süreçlerine katıldığı bilinen doğal öldürücü hücreler gibi diğer CD11b+ bağışıklık hücrelerini ortadan kaldırmak için CD45intCD11byüksek hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması takip eder (7)27,28,48. Farklı CNS’de yerleşik hücre tiplerinin izolasyonundan sonra saflık analizleri yapılabilir (9). Kısaltmalar: Abs = antikorlar; ACSA-2 = astrosit hücre yüzeyi antijeni-2; CD11b = sikline bağımlı kinaz 11B; CD45 = reseptör tipi tirozin-protein fosfataz C; CNS = merkezi sinir sistemi; EAE = deneysel otoimmün ensefalomiyelit; MACS = manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması; O4 = oligodendrosit belirteci O4. Bu rakam49’dan değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 1. Aktif EAE’nin indüksiyonu Reaktiflerin hazırlanmasıHücre ayrımı için: PB tamponunu hazırlayın ve 2-8 °C’de en fazla 1 hafta saklayın. Stok çözelti hazırlamak için, takviyesiz 475 mL 1x PBS (pH 7.2) + 25 mL% 0.5 sığır serum albümini (BSA) ekleyin. BSA’da hazırlanmış 1:20 seyreltme kullanın. Akış sitometrisi ve floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) için: FACS tamponunu, PBS’yi %2 fetal buzağı serumu (FCS) ve 2 mM EDTA ile hazırlayın ve 2-8 °C’de saklayın. Hazırlamak için, takviyeler olmadan 500 mL 1x PBS ve 10 mL FCS + 2 mL EDTA (0,5 M EDTA stoğundan) ekleyin Bittner ve ark. 5. Kısaca, 200 μg MOG35-55 peptid ve 200 μg Mycobacterium tuberculosis içeren 200 μL tam Freud adjuvanı içeren bir emülsiyonun subkutan enjeksiyonu ile EAE’yi indükleyin. İzofluran buharlaştırıcılı bir anestezi odası kullanarak fareyi %2 izofluran ile uyuşturun. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için hayvanın gözlerine veteriner merhemi kullanın. 2 saat sonra, Huntemann ve ark.24’ün protokolüne göre 100 μL 1x PBS içinde çözülmüş 100 ng Boğmaca toksini (PTx) intraperitoneal enjeksiyonu enjekte edin. Bağışıklamadan sonraki 2. günde PTx enjeksiyonunu tekrarlayın.DİKKAT: Sternal yaslığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar her hayvanı gözlemleyin. Enjeksiyon prosedürlerinden geçen fareler, tamamen iyileşene kadar diğer farelerin şirketine iade edilmez. Mycobacterium tuberculosis ve PTx için: Solumaktan, yutmaktan ve cilt ve gözlerle temasından kaçının. Mycobacterium tuberculosis , doğuştan gelen bağışıklık sisteminin bir aktivatörüdür. PTx’in birçok biyolojik etkisi vardır. Ağırlığı izleyen ve fareleri klinik olarak inceleyen iki kör araştırmacı tarafından gerçekleştirilen EAE ilerlemesini günlük olarak izleyin. Bu amaçla derece 0-EAE klinik bulgusu yok, evre 1-parsiyel kuyruk parezi, evre 2-tam kuyruk parezi, derece 3-orta derecede arka ekstremite güçsüzlüğü, grade 4-tam arka ekstremite güçsüzlüğü ve ataksik yürüyüş, grade 5-hafif paraparezi, grade 6-paraparezi, grade 7-parapleji, grade 8-tetraparezi, grade 9-kuadripleji, ve 10. sınıf ölüm. Deneye daha fazla katılım için aşağıdaki dışlama kriterlerini kullanın: klinik puan > 7 veya başlangıç vücut ağırlığının% 20’sini aşan bir kilo kaybı. Beynin ve omuriliğin diseksiyonu için, EAE farelerini EAE indüksiyonundan sonraki 16. günde ötenazi yapın ve hastalık maksimumunu temsil edin. 2. CNS doku hazırlığı (Süre: fare başına yaklaşık 10 dakika) Fareleri karbondioksit ile feda ettikten sonra, her farenin 20 mL 1x PBS ile transkardiyal perfüzyonu ile başlayın. Perfüzyonu 20 mL 1x PBS ile tekrarlayın. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve uzuvları kanüllerle sabitleyin. Hayvanın ön gövdesine% 75 etanol uygulayın. Bu noktada daha fazla sterilite önlemi gerekli değildir. Bir makas yardımıyla cilt ve fasyadan uzunlamasına bir kesit yaparak karın ve göğüs boşluğunu açın. Kaburgaları yanal olarak kesin ve kalbe serbest erişim sağlamak için göğüs kafesi katlayın. Yukarı doğru katlanmış toraksı kanüllerle sabitleyin. Makas kullanarak sağ atriyumu açın. Kanı kesilen sağ atriyumdan dışarı atmak için bir kanül ile sol ventriküle 20 mL 1x PBS uygulayın. Uzunlamasına bir bölümden murin kafasının üstündeki cildi keserek kafatasını ortaya çıkarın ve bir forseps kullanarak cildi başın etrafında kaydırın. Kafatasını sagital sütür boyunca bir makas yardımıyla kesin. Kalotte’u açmak için bir forsepsin ucunu insizyon hattı boyunca sokun. Beynin tamamen açığa çıkması için kalaotun kalan kısımlarını forseps ile çıkarın. Beyni dikkatlice çıkarın ve bir murin beyin matrisine yerleştirin. Bir tıraş bıçağı kullanarak beyni 1 mm kalınlığında sagital dilimler halinde kesin. Şırınganın omurilik kanalına yerleştirilebilmesi için vertebral kolonu iliak krestin hemen üstünden makas yardımıyla kesin.NOT: Omuriliği çıkarmanın en kolay yolu, onu PBS ile omurilik kanalından dışarı atmaktır. Aksi takdirde omur kemerlerinin makasla tek tek açılması gerekir ve ardından omurilik çıkarılabilir. 1x PBS içeren 20G iğne ile 20 mL’lik bir şırınga kullanarak omuriliği kaudalden kraniyal kanaldan dışarı atın. Omuriliği bir neşter kullanarak 0,5 cm uzunluğunda parçalara ayırın. Beyin ve karşılık gelen omurilikten oluşan her bir CNS hücre süspansiyonunu, yaklaşık 3 mL soğuk D-PBS ile doldurulmuş fare başına ayrı bir Petri kabında saklayın. Bulaşıkları daha fazla işlenene kadar buz üzerinde saklayın. 3. CNS doku ayrışması (Süre: CNS hücre süspansiyonlarının sayısına bağlı olarak yaklaşık 1-1.5 saat) NOT: Yetişkin farelerden alınan nöral doku, mekanik ayrışmanın hücre dışı matrisin enzimatik bozunması ile birleştirilmesiyle ayrıştırılır. Böylece yapısal bütünlük korunur ve hücre süspansiyonu daha ileri hücre izolasyon prosedürleri için kullanılabilir. CNS hücre süspansiyonu başına 50 μL P enzimi ve 1.900 μL tampon Z’den oluşan uygun hacimde enzim karışımı 1 hazırlayın. Her iki reaktif de yetişkin beyin ayrışma kitine aittir. CNS hücre süspansiyonu başına 10 μL enzim A ve 20 μL tampon Y’den oluşan uygun hacimde enzim karışımı 2 hazırlayın. Her iki reaktif de yetişkin beyin ayrışma kitine aittir. 1.950 μL enzim karışımı 1’i C tüpüne aktarın ve daha sonra bir CNS hücre süspansiyonunun doku parçalarını ekleyin. Fare başına bir C tüpü kullanın. Her C tüpüne 30 μL enzim karışımı 2 ekleyin. C tüplerini sıkıca kapatın ve ısıtıcılarla hücre ayrıştırıcının manşonuna baş aşağı takın. 37C_ABDK_01 adlı uygun programı çalıştırın (30 dakika sürer). Tüm tüplerin aynı hızda döndüğünden emin olmak için programın en az ilk 5 dakikasına uyun. Çalışma sırasında hataların oluşması mümkündür. Ardından, 6. adıma geçin. Programın son 2 dakikasında, her ayrışmış CNS hücre süspansiyonu için 50 mL’lik bir tüpe 70 μm’lik bir süzgeç yerleştirin. Bu süzgeçleri 2 mL D-PBS ile önceden nemlendirin. Programın sonlandırılmasından sonra, C tüplerini ayrıştırıcıdan takın ve bir santrifüje yerleştirin. Numuneyi tüpün dibinde toplamak için numuneleri 300 x g ve 4 °C’de 1 dakika santrifüjleyin. Numuneyi tekrar süspanse edin ve önceden nemlendirilmiş süzgecin üzerine uygulayın. Boş C tüpüne 10 mL soğuk D-PBS ekleyin ve kapatın. Hafifçe sallayın ve süspansiyonu ilgili süzgecin üzerine uygulayın. Süzgeçleri atın ve 50 mL’lik tüpleri kapatın. Hücre süspansiyonunu 300 x g ve 4 °C’de 10 dakika santrifüj edin. Daha sonra, tüm süpernatanı çok dikkatli bir şekilde aspire edin. 4. Enkaz kaldırma (Süre: CNS hücre süspansiyonlarının sayısına bağlı olarak yaklaşık 1.5-2 saat) NOT: Doku ayrışması genellikle aşağı akış analizini bozabilecek miyelin ve hücre kalıntılarına yol açar. Bir enkaz temizleme çözümü ekleyerek, bu kalıntı CNS hücre süspansiyonundan verimli bir şekilde çıkarılabilir. Her CNS hücre süspansiyonu için hücre peletini 3.100 μL D-PBS ile dikkatlice yeniden süspanse edin. Girdap yapmayın. Birden fazla CNS hücre süspansiyonu ile çalışıyorsanız, bir koşuldan veya deney grubundan türetilen maksimum iki CNS hücre süspansiyonunu bir 15 mL’lik tüpte toplayın. Yetişkin beyin ayrışma kitinden bir CNS hücre süspansiyonuna 900 μL enkaz giderme solüsyonu veya iki havuzlanmış CNS hücre süspansiyonuna 1.800 μL enkaz giderme solüsyonu ekleyin. Tüpü ters çevirin ve süspansiyonu karıştırın. Daha sonra, 4 mL soğuk D-PBS ile çok nazikçe kaplayın. Net bir gradyan görünür olmalıdır (Şekil 2A). Tüpleri 10 dakika boyunca 3000 x g ve 4 °C’de tam hızlanma ve frensiz olarak santrifüjleyin. Ayırma amaçlandığı gibi gerçekleşirse, üç faz oluşur (Şekil 2C). En üstteki iki fazı tamamen aspire edin (Şekil 2C-1,2) ve atın. Geride miyelin kalıntısı kalmaması önemlidir (Şekil 2E).NOT: Gradyan işe yaramadıysa ve hücrelere acilen ihtiyaç duyuluyorsa, en üstteki iki fazı emmeyin. Bunun yerine, 15 mL’lik tüpü 15 mL’ye kadar soğuk D-PBS ile doldurun ve birkaç kez ters çevirin. 1000 x g’de 10 °C’de 4 dakika boyunca tam hızlanma ve frensiz olarak tekrar santrifüj edin. Süpernatanı emdirin ve 4.1-4.4 adımlarını tekrarlayın. Tüpü 14 mL’ye kadar soğuk D-PBS ile doldurun ve kapatın. Hücre peleti tüpün altından ayrılana kadar tüpü çalışma tezgahında güçlü bir şekilde ters çevirin. Girdap yapmayın. Numuneyi 1000 x g ve 4 °C’de 10 dakika boyunca tekrar santrifüj edin. Tam hızlanma ve tam fren ayarlayın. Süpernatanı dikkatlice ve tamamen aspire edin. Şekil 2: Enkaz kaldırma sırasında yapılması ve yapılmaması gerekenler. (A) 4 mL PBS ile bindirildikten sonra gradyan için pozitif örnek. 4 mL PBS’den oluşan üst faz, enkaz giderme solüsyonu ile CNS hücre süspansiyonundan oluşan alt fazdan açıkça ayırt edilebilir. (B) 4 mL PBS ile üst üste bindirildikten sonra gradyan için negatif örnek. Gradyan, PBS ile aşağıdaki hücre süspansiyonu arasında net bir ayrımdan yoksundur. PBS’nin bir kısmı hücre süspansiyonuna yayılır. (C) Santrifüjlemeden sonraki gradyan için pozitif örnek. Üç ayrı faz kolayca ayırt edilebilir. Gradyanın üst (1) veya alt fazında (3) miyelin kalıntısı görünmez. Orta faz tüm miyelini içerir (2). Hücre peleti 15 mL’lik tüpün dibinde görülebilir. (D) Santrifüjlemeden sonra gradyan için negatif örnek. Mümkün olan üç faz arasında kesin bir ayrım yoktur. Bazı miyelin kalıntıları, gradyanın üst (1) ve alt fazında (3) görülebilir. (E) İki üst fazı aspire ettikten sonra gradyan için olumlu örnek. Elde edilen numune sadece hücre peletini ve yukarıda berrak bir süpernatant içerir. Geride miyelin kalıntısı kalmaz. (F) İki üst fazı aspire ettikten sonra gradyan için negatif örnek. Numune hala bazı miyelin kalıntıları (siyah ok) içeriyor. Kısaltmalar: CNS = merkezi sinir sistemi; PBS = fosfat tamponlu salin Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 5. Kırmızı kan hücresi çıkarılması (Süre: CNS hücre süspansiyonlarının sayısına bağlı olarak yaklaşık 1 saat) NOT: Bu adım, daha sonra kırmızı kan hücreleri tarafından kontaminasyonu önler ve CNS dokusundan izole edilen diğer hücre tipleri üzerinde minimum etki ile eritrositlerin optimal bir şekilde parçalanmasını sağlar. Aşağıdaki hacimler, iki yetişkin fare beynine ve omuriliğine karşılık gelen 100 mg ila 1 g nöronal dokudan türetilen hücre süspansiyonları için endikedir. İkiden fazla CNS hücre süspansiyonu ile çalışıyorsanız, tüm reaktifleri ve toplam hacimleri buna göre ölçeklendirin. Kırmızı kan hücresi çıkarma çözeltisinin (RBCRS) hazırlanmasıyla başlayın: havuzlanmış iki CNS hücre süspansiyonu başına. 1:10’luk bir nihai seyreltmeye ulaşmak için yetişkin beyin ayrışma kitinden 100 μL kırmızı kan hücresi çıkarma stok solüsyonunu (10x) 900 μLddH2Oiçinde seyreltin. RBCRS’yi kullanana kadar 2-8 °C’de saklayın. Günün sonunda kullanılmayan kalıntıları atın. RBCRS’nin 1 mL’sinde iki CNS hücre süspansiyonuna kadar hücre peletini yeniden süspanse edin. Girdaptan kaçının. Çözeltiyi 4 °C’de 10 dakika inkübe edin. İki havuzlanmış hücre süspansiyonuna 10 mL soğuk PB tamponu ekleyin. Numuneyi 300 x g ve 4 °C’de 10 dakika santrifüjleyin ve daha sonra süpernatanı tamamen aspire edin. Her bir hücre peletini bir CNS hücre süspansiyonundan 80 μL PB tamponunda yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Buna göre, iki CNS hücre süspansiyonundan türetilen hücre peletlerini yeniden süspanse etmek için 160 μL kullanın. Aynı deneysel koşuldan birkaç CNS hücre süspansiyonu ile çalışırken, tüm bu hücre süspansiyonlarını bir araya getirin. Hücre sayısını belirleyin, örneğin gelişmiş bir sayım odası kullanarak. Hücre süspansiyonları genellikle PB tamponunda 1:50 oranında seyreltildi, ardından %0.4 tripan mavisi çözeltisinde 1:10’luk bir seyreltme daha yapıldı. 6. Naif ve EAE farelerde manyetik boncuk protokolü (Süre: Yaklaşık 1 saat) Farklı CNS hücre tiplerini, yüzey antijenlerine özgü MicroBeads ile manyetik olarak etiketleyin. Ardından, hücre süspansiyonunu sütuna yerleştirin ve sütun içinde tutulan etiketli hücreleri ve içinden geçen etiketsiz hücreleri manyetik olarak ayırın. Kolonu manyetik alandan çıkardıktan sonra, manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri, pozitif olarak seçilmiş hücre fraksiyonu olarak kolondan bir tüpe boşaltın.NOT: Manyetik etiketleme işlemi için hacimler, toplam 1 x 107 hücreye kadar hesaplanır. Daha fazla hücre elde edilirse, tüm reaktifleri ve toplam hacimleri buna göre ölçeklendirin. Hücre yüzeyinde antikorların kapanmasını ve spesifik olmayan hücre etiketlemesini önlemek ve izole hücre popülasyonlarının yüksek canlılığını sağlamak için hızlı çalışılması ve sadece önceden soğutulmuş solüsyonların kullanılması önerilir. Kolonların kurumaması için kolon haznesi boşalır boşalmaz PB tamponu eklenerek yıkama adımlarının gerçekleştirilmesi de önemlidir. Saflaştırılmış seyreltilmemiş CNS hücre süspansiyonunu, aşağıdaki mikroglia ve oligodendrosit izolasyonları için iki fraksiyona bölün. Her iki fraksiyonun oranı, her hücre tipinin istenen hücre sayısına bağlıdır.NOT: Daha fazla ayrıntı (inkübasyon süresi, ayrıntılı protokol adımları, hacimler, reaktifler ve hücre sayımı yöntemi) Tablo 1’de belirtilmiştir. Tablo 1: Saf ve EAE farelerinden oligodendrositlerin ve mikrogliaların eşzamanlı manyetik etiketlemesi ve izolasyonu için iş akışı. Her iki hücre tipi de pozitif bir seçim yoluyla izole edilir. Aynı satırda listelenen adımların bir kerede gerçekleştirileceği belirtilir. Kısaltmalar: CD11b = siklin bağımlı kinaz 11B; EAE = deneysel otoimmün ensefalomiyelit; FcR = Fc reseptörü benzeri protein; O4 = oligodendrosit belirteci O4. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın. 7. Protokol değişikliği: EAE farelerinde mikroglia izolasyonu için ek sıralama (Süre: Yaklaşık 1.5-2 saat) NOT: EAE fareleri ile çalışırken, mikroglia dışındaki CD11b + hücre popülasyonlarını (örneğin, monositler, makrofajlar, doğal öldürücü hücreler, granülositler veya dendritik hücreler) CD11b + hücre fraksiyonundan çıkarmak için MACS tabanlı hücre izolasyon protokolünü FACS ile tamamlamak gerekir. Aksi takdirde, bu adım göz ardı edilebilir. CD1b FITC (klon M1/70, 1:50) ve CD45 APC/Cy7 (klon 30-F11, 1:200) ile desteklenmiş 1x PBS içeren boyama ana karışımını hazırlayın. 5 x 106 hücre başına 100 μL boyama ana karışımı kullanın. Kullanmadan önce tüm antikorları vorteksleyin. Mikroglia hücre süspansiyonunu 300 x g ve 4 °C’de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice aspire edin. Hücre peletini 5 x 106 hücre başına 100 μL hazırlanmış boyama ana karışımı ile yeniden süspanse edin. Karanlıkta oda sıcaklığında (RT) 15 dakika inkübe edin. 500 μL PBS ekleyerek reaksiyonu durdurun ve numuneyi 300 x g ve 4 °C’de 10 dakika boyunca tekrar santrifüj edin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini 10 μg/mL DNAse ile desteklenmiş 1x PBS ile yeniden süspanse ederek mL başına 1 x 107 hücrelik bir nihai konsantrasyona ulaşın. Hücreleri sıralama başlayana kadar 4 °C’de saklayın. Hücre süspansiyonunu, sıralamaya başlamadan hemen önce yeni bir FACS tüpüne yerleştirilmiş 100 μm’lik bir süzgecin üzerine uygulayın. Akış hızını saniyede 1000 olaya ayarlayın ve 100 μm nozulu kullanın. CD45intCD11byüksek hücrelerinin istenen hücre popülasyonunu, RT’de 1x PBS ile hazırlanan yeni bir 15 mL’lik tüpe sıralayın. 8. Nöronların ve astrositlerin izolasyonu için oligodendrositlerin negatif akışının hazırlanması (Süre: Yaklaşık 1 saat) NOT: Adım 6’dan oligodendrositlerin negatif akışı, nöronların ve astrositlerin daha fazla izolasyonu için toplanır. Bu amaçla, hücre süspansiyonu iki parçaya bölünür. Oligodendrositlerin CNS hücre süspansiyonundan önceki izolasyonu nedeniyle, aksi takdirde gözlemlenecek olan O4+ hücreleri tarafından kontaminasyon en aza indirilir. Oligodendrositlerin negatif akışını 300 x g ve 4 ° C’de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice aspire edin. Hücre peletini, daha önce oligodendrosit pozitif fraksiyonunun izolasyonu için kullanılan havuzlanmış CNS hücre süspansiyonu başına 80 μL PB tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın. Hücre süspansiyonunu PB tamponunda 1:50 oranında seyrelttikten ve ardından %0.4 tripan mavisinde 1:10 seyrelttikten sonra geliştirilmiş bir sayma odası kullanarak O4- olduğu varsayılan hücrelerin sayımını gerçekleştirin. Saflaştırılmış seyreltilmemiş hücre süspansiyonunu, nöronların ve astrositlerin aynı anda izolasyonu için iki fraksiyona bölün. Her iki fraksiyonun oranı, her hücre tipinin tercih edilen miktarına bağlıdır.NOT: Daha fazla ayrıntı (inkübasyon süresi, ayrıntılı protokol adımları, hacimler, reaktifler ve hücre sayımı yöntemi) Tablo 2’de belirtilmiştir. Tablo 2: Saf ve EAE farelerinden nöronların ve astrositlerin eşzamanlı manyetik etiketlemesi ve izolasyonu için iş akışı. Her iki hücre tipi de oligodendrositlerin negatif akışından izole edilir. Astrositler, anti-ACSA-2 mikro boncukları yoluyla pozitif bir seleksiyon olarak ayrılırken, nöronlar, negatif bir seleksiyon olarak tüm nöronal olmayan hücrelerin biyotinilasyonu ve tükenmesi yoluyla saflaştırılır. Aynı satırda listelenen adımların bir kerede gerçekleştirileceği belirtilir. Kısaltmalar: Anti-ACSA-2 = astrosit hücre yüzeyi antijeni-2; EAE = deneysel otoimmün ensefalomiyelit; FcR = Fc reseptörü benzeri protein; MACS = manyetik olarak etkinleştirilen hücre sıralaması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın. 9. İzole CNS’de yerleşik hücre tiplerinin saflık analizleri (Süre: Yaklaşık 2 saat) NOT: Saflıklarını ve canlılıklarını ölçmek ve karşılaştırmak için izole edilmiş dört CNS’de yerleşik hücre popülasyonunun tümünün akış sitometrisinin yapılması önerilir. Bu nedenle, tüm hücre tiplerini florofor ile etiketlenmiş bir antikorla boyamak gerekir. Canlı/ölü hücre boyama, sabitlenebilir bir canlılık boyası (1:10.000) kullanılarak uygulanır. Saflık paneli – hücre dışı boyama protokolüBoyama başına 50 μL PBS içinde çözülmüş 1 x 105 hücre kullanın. Hücre tipine özgü yüzey belirteçlerini hedefleyen aşağıdaki florokrom konjuge monoklonal antikorlardan oluşan% 2 FCS / 2 mM EDTA ile PBS içinde çözülmüş boyama ana karışımını hazırlayın: CD11b FITC (klon 1/70, 1:100)25,26,27,28, Biotin-PE (klon Bio3-18E7, 1:200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (klon REA-969, 1:200)33,34,35, O4 APC (klon REA-576, 1:400) ve CD45 BV510 (klon 30-F11, 1:150)36,37. Fc reseptörünü bloke etmek için 1 x 106 hücre başına 1 μg anti-CD16/32 ekleyin3 8,39. Kullanmadan önce tüm antikorları vorteksleyin. Hücre süspansiyonunu 540 x g ve 4 °C’de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice aspire edin. Hücre peletini ilgili ana karışımın 100 μL’sinde yeniden süspanse edin ve numuneyi karanlıkta RT’de 15 dakika inkübe edin. Hücreleri %2 FCS/2 mM EDTA ile 500 μL 1x PBS ile yıkayın ve numuneyi 540 x g ve 4 °C’de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini %2 FCS/2 mM EDTA ile 70 μL 1x PBS ile yeniden süspanse edin. Hücre peletini tamamen ayırmak için numuneyi vorteksleyin. Daha sonra, numune akış sitometrisi analizi için hazırdır. Saflık paneli – NeuN ile hücre içi boyama protokolüNörona özgü bir nükleer belirteç olan NeuN’nin hücre içi boyanması için her hücre popülasyonundan 1 x 105 hücre kullanın 40,41. Bu, canlı nöronları boyamanın ek bir yoludur. Her hücre popülasyonunun 1 x 105 hücresini bir FACS tüpüne aktarın. Tüp başına% 2 FCS / 2 mM EDTA ile 1 mL PBS ekleyin. Tüpleri 540 x g ve 4 °C’de 5 dakika santrifüjleyin. Bu arada, hücre tipine özgü yüzey belirteçlerini hedefleyen aşağıdaki florokrom konjuge monoklonal antikorlardan oluşan %2 FCS/2 mM EDTA ile PBS’de çözünmüş ana karışımı hazırlayın: CD11b FITC (klon M1/70, 1:100)25,26,27,28, Biotin-PE (klon Bio3-18E7, 1:200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (klon REA-969, 1:200)33,34,35 ve CD45 BV510 (klon 30-F11, 1:150)36,37. Süpernatanı aspire edin ve hazırlanan ana karışımın 100 μL’lik hücrelerinde hücreleri yeniden süspanse edin ve numuneyi karanlıkta RT’de 10 dakika inkübe edin. Hücreleri %2 FCS/2 mM EDTA ile 100 μL PBS ile yıkayın ve 540 x g ve 4 °C’de 5 dakika boyunca tekrar santrifüj edin. Bu arada, 200 μL fiksasyon/geçirgenleştirme çözeltisi hazırlayın: 1:4’lük bir nihai seyreltmeye ulaşmak için 150 μL fiksasyon/geçirgenleştirme seyrelticisine 50 μL konsantre fiksasyon/geçirgenleştirme konsantresi stoğu ekleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 100 μL 1x fiksasyon / geçirgenleştirme çözeltisinde yeniden süspanse edin. Numuneyi 4 °C’de 30 dakika inkübe edin. Bu arada, 1:10’luk bir nihai seyreltmeye ulaşmak için 900 μL ddH2O’ya 100 μL geçirgenleştirme tamponu stoğu ekleyerek 1 mL 1x geçirgenleştirme/yıkamatamponu hazırlayın. Hücreleri 1 kez 100 μL 1x geçirgenleştirme/yıkama tamponu ile yıkayın ve numuneyi 540 x g ve 4 °C’de 5 dakika santrifüjleyin. Bu arada, Fc reseptörünü bloke etmek için sadece NeuN (NeuN AF647, klon EPR12763, 1:200) ve 106 hücre başına 1 μg anti-CD16/32’den oluşan 1x geçirgenlik/yıkama tamponunda başka bir ana karışım hazırlayın. Süpernatanı aspire edin. Sabit ve geçirgen hücreleri ikinci ana karışımın 50 μL’sinde yeniden süspanse edin ve 4 ° C’de 30 dakika inkübe edin. Numuneyi 100 μL 1x geçirgenleştirme/yıkama tamponu ile yıkayın ve 540 x g ve 4 °C’de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini %2 FCS / 2 mM EDTA ile 70 μL PBS’de yeniden süspanse edin. Daha sonra, numune akış sitometrik analizi için hazırdır. Akış sitometresinde paneli kurduktan sonra, bir akış sitometrisi analiz yazılımı kullanarak saflık analizi için hücreler edinin. 10. İstatistiksel analiz Grafiksel analiz programı ile istatistiksel analizler yapın ve grafikler tasarlayın. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur.