Aislamiento simultáneo de los principales tipos de células residentes en el sistema nervioso central de ratones adultos con encefalomielitis autoinmune

Todos los experimentos de EAE fueron inducidos en ratones hembra C57BL/6J a la edad de 10-12 semanas y aprobados por las autoridades locales (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen). También se garantizó el cumplimiento de la legislación alemana y de la UE en materia de protección animal en todo momento de los experimentos. Todos los ratones se mantuvieron en jaulas ventiladas individualmente en condiciones de alojamiento de animales. NOTA: Los siguientes volúmenes de reactivos se refieren a un cerebro murino adulto y a la médula espinal, que se denominan suspensión de células del SNC en el siguiente documento y pesan aproximadamente entre 20 mg y 500 mg. Si se planea la disociación de más de una suspensión de células del SNC, todos los volúmenes de reactivos y materiales deben ampliarse en consecuencia. Se recomienda almacenar la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS; 1x) con calcio y magnesio, suplementada con 1 g/L de glucosa y 36 mg/L de piruvato de sodio) de forma continua en hielo durante todo el experimento. Si el cultivo de células se planifica después, realice todos los pasos en condiciones estériles mediante el uso de campanas. De lo contrario, no es necesario realizar ninguna de las siguientes secciones del protocolo bajo capó. Guarde los tampones en hielo. Utilice solo soluciones preenfriadas y evite el vórtice durante todo el experimento. Consulte la figura 1 para ver el flujo de trabajo general. Figura 1: Flujo de trabajo para el aislamiento simultáneo de oligodendrocitos, microglía, astrocitos y neuronas en ratones naïve y EAE. Los primeros pasos del flujo de trabajo son los mismos tanto para los ratones naïve como para los EAE. Si se desea trabajar con una réplica de EAE, se debe realizar previamente la inducción de EAE (1). En resumen, el protocolo comienza con la disección (2) y disociación (3) del cerebro y la médula espinal murinos, seguida de la eliminación de restos (4) y glóbulos rojos (5). Posteriormente, la suspensión de células del SNC purificada resultante se divide en dos fracciones para el aislamiento simultáneo de oligodendrocitos y microglía a través de MACS (6). La microglía se detecta a través de microesferas anti-CD11b, mientras que los oligodendrocitos se aíslan mediante microesferas anti-O4 (selecciones positivas). A partir del flujo negativo de los oligodendrocitos (8), los astrocitos se aíslan a través de microesferas anti-ACSA-2 (selección positiva) y las neuronas mediante el marcaje de biotina y el agotamiento de todas las células no neuronales (selección negativa). En ratones EAE, el aislamiento de las células CD11b+ es seguido por la clasificación celular activada por fluorescenciade las células altas CD45intCD11b para eliminar otras células inmunitarias CD11b+ como macrófagos, células dendríticas, monocitos, granulocitos y células asesinas naturales que se sabe que participan en procesos de neuroinflamación durante el curso de EAE (7)27,28,48. Tras el aislamiento de los diferentes tipos de células residentes en el SNC, se pueden realizar análisis de pureza (9). Abreviaturas: Abs = anticuerpos; ACSA-2 = antígeno 2 de la superficie de la célula de astrocitos; CD11b = quinasa 11B dependiente de ciclina; CD45 = tirosina y proteína fosfatasa C de tipo receptor; SNC = sistema nervioso central; EAE = encefalomielitis autoinmune experimental; MACS = clasificación de células activadas magnéticamente; O4 = marcador de oligodendrocitos O4. Esta cifra ha sido modificada de49. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 1. Inducción de EAE activa Preparación de reactivosPara la separación celular: Prepare el tampón PB y guárdelo a 2-8 °C durante un máximo de 1 semana. Para preparar la solución madre, añadir 475 mL de 1x PBS sin suplementos (pH 7,2) + 25 mL de albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5%. Utilice una dilución 1:20 preparada en BSA. Para citometría de flujo y clasificación celular activada por fluorescencia (FACS): Prepare el tampón FACS, PBS con suero fetal de ternero (FCS) al 2% y EDTA 2 mM y guárdelo a 2-8 °C. Para prepararlo, añadir 500 mL de 1x PBS sin suplementos y 10 mL de FCS + 2 mL de EDTA (a partir de 0,5 M de EDTA stock) Realizar la inmunización de acuerdo con el protocolo de Bittner et al. 5. En resumen, inducir EAE mediante inyección subcutánea de una emulsión que contenga 200 μg de péptido MOG35-55 y 200 μL de adyuvante completo de Freud incluyendo 200 μg de Mycobacterium tuberculosis. Anestesiar al ratón con isoflurano al 2% mediante el uso de una cámara de anestesia con un vaporizador de isoflurano. Use ungüento veterinario en los ojos del animal para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia. Después de 2 h, inyectar una inyección intraperitoneal de 100 ng de toxina de la tos ferina (PTx) disuelta en 100 μL de 1x PBS según el protocolo de Huntemann et al.24. Repita la inyección de PTx el día 2 después de la inmunización.PRECAUCIÓN: Observe a cada animal hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Los ratones que se han sometido a los procedimientos de inyección no se devuelven a la compañía de los otros ratones hasta que se hayan recuperado por completo. Para Mycobacterium tuberculosis y PTx: Evite la inhalación, ingestión y contacto con la piel y los ojos. Mycobacterium tuberculosis es un activador del sistema inmune innato. El PTx tiene muchos efectos biológicos. Monitorizar diariamente la progresión de la EAE, realizada por dos investigadores ciegos que controlan el peso y examinan clínicamente a los ratones. Para ello, se utilizó el siguiente sistema de puntuación: grado 0-sin signos clínicos de EAE, grado 1- paresia parcial de la cola, grado 2-paresia completa de la cola, grado 3-debilidad moderada de las extremidades posteriores, grado 4-completa debilidad de las extremidades posteriores y marcha atáxica, grado 5-paraparesia leve, paraparesia de grado 6, paraplejia de grado 7, tetraparesia de grado 8, grado 9-cuadriplejia, y grado 10-muerte. Utilice los siguientes criterios de exclusión para una mayor participación en el experimento: puntuación clínica > 7 o una pérdida de peso superior al 20% del peso corporal inicial. Para la disección del cerebro y la médula espinal, se practica la eutanasia a los ratones EAE el día 16 después de la inducción de EAE, lo que representa el máximo de la enfermedad. 2. Preparación del tejido del SNC (Duración: aproximadamente 10 min por ratón) Después de sacrificar ratones con dióxido de carbono, comience con la perfusión transcárdica de cada ratón con 20 mL de 1x PBS. Repita la perfusión nuevamente con 20 ml de 1x PBS. Coloque el ratón en posición supina y fije las extremidades con cánulas. Aplicar etanol al 75% en la parte frontal del cuerpo del animal. En ese momento, no son necesarias más medidas de esterilidad. Abre el abdomen y el tórax haciendo un corte longitudinal a través de la piel y la fascia con la ayuda de una tijera. Corta las costillas lateralmente y dobla el tórax hacia arriba para tener libre acceso al corazón. Fijar el tórax doblado hacia arriba con cánulas. Abra la aurícula derecha con unas tijeras. Aplique 20 ml de 1x PBS en el ventrículo izquierdo con una cánula para eliminar la sangre a través de la aurícula derecha incisa. Exponga el cráneo cortando la piel en la parte superior de la cabeza murina a través de una sección longitudinal y mueva la piel alrededor de la cabeza con una pinza. Incidir el cráneo con ayuda de una tijera a lo largo de la sutura sagital. Inserte la punta de una pinza a lo largo de la línea de incisión para abrir la calota. Retire las partes restantes de la calota con fórceps para que el cerebro quede completamente expuesto. Retire el cerebro con cuidado y colóquelo en una matriz cerebral murina. Corta el cerebro en rodajas sagitales de 1 mm de grosor con una cuchilla de afeitar. Cortar la columna vertebral con ayuda de unas tijeras justo por encima de la cresta ilíaca para que la jeringa pueda introducirse en el canal espinal.NOTA: La forma más fácil de extirpar la médula espinal es sacarla del canal espinal con PBS. De lo contrario, los arcos vertebrales deben abrirse individualmente con unas tijeras y luego se puede extirpar la médula espinal. Enjuague la médula espinal del canal espinal desde la caudal hasta la craneal utilizando una jeringa de 20 ml con una aguja de 20 g que contenga 1x PBS. Corta la médula espinal en segmentos de 0,5 cm de largo con un bisturí. Almacene cada suspensión de células del SNC que consiste en el cerebro y la médula espinal correspondiente en una placa de Petri separada por ratón llena de aproximadamente 3 ml de D-PBS frío. Guarde los platos en hielo hasta su posterior procesamiento. 3. Disociación tisular del SNC (Duración: aproximadamente 1-1,5 h dependiendo del número de suspensiones celulares del SNC) NOTA: El tejido neural de ratones adultos se disocia combinando la disociación mecánica con la degradación enzimática de la matriz extracelular. De este modo, la integridad estructural se mantiene y la suspensión celular se puede utilizar para otros procedimientos de aislamiento celular. Preparar el volumen adecuado de la mezcla enzimática 1 que consiste en 50 μL de enzima P y 1.900 μL de tampón Z por suspensión celular del SNC. Ambos reactivos pertenecen al kit de disociación cerebral adulta. Preparar el volumen adecuado de mezcla de enzimas 2 que consiste en 10 μl de enzima A y 20 μl de tampón Y por suspensión celular del SNC. Ambos reactivos pertenecen al kit de disociación cerebral adulta. Transfiera 1.950 μL de mezcla enzimática 1 en el tubo C y agregue los trozos de tejido de una suspensión de células del SNC después. Utilice un tubo C por ratón. Agregue 30 μL de mezcla de enzimas 2 a cada tubo C. Cierre bien los tubos C y fíjelos boca abajo en el manguito del disociador de celdas con calentadores. Ejecute el programa apropiado llamado 37C_ABDK_01 (tarda 30 minutos). Observe al menos los primeros 5 minutos del programa para asegurarse de que todos los tubos giren a la misma velocidad. Es posible que se produzcan errores durante la ejecución. A continuación, continúe con el paso 6. En los últimos 2 minutos del programa, coloque un colador de 70 μm en un tubo de 50 ml por cada suspensión de células disociadas del SNC. Humedece previamente estos coladores con 2 ml de D-PBS. Después de finalizar el programa, conecte los tubos C del disociador y colóquelos en una centrífuga. Centrifugar las muestras a 300 x g y 4 °C durante 1 min para recoger la muestra en el fondo del tubo. Vuelva a suspender la muestra y aplíquela al colador previamente humedecido. Agregue 10 ml de D-PBS frío al tubo C vacío y ciérrelo. Agítalo suavemente y aplica la suspensión sobre el colador correspondiente. Deseche los filtros y cierre los tubos de 50 ml. Centrifugar de nuevo la suspensión celular a 300 x g y 4 °C durante 10 min. Después, aspire todo el sobrenadante con mucho cuidado. 4. Eliminación de residuos (Duración: Aproximadamente 1,5-2 h dependiendo del número de suspensiones de células del SNC) NOTA: La disociación tisular a menudo conduce a mielina y restos celulares que pueden afectar el análisis posterior. Al agregar una solución de eliminación de escombros, estos desechos se pueden eliminar de manera eficiente de la suspensión de la celda del SNC. Vuelva a suspender el gránulo celular con cuidado con 3.100 μL de D-PBS para cada suspensión de células del SNC. No haga vórtices. Si trabaja con más de una suspensión de células del SNC, agrupe un máximo de dos suspensiones de células del SNC derivadas de una afección o grupo experimental en un tubo de 15 ml. Agregue 900 μL de la solución de eliminación de residuos del kit de disociación cerebral adulta a una suspensión de células del SNC o 1.800 μL de solución de eliminación de residuos a dos suspensiones de células del SNC combinadas. Invierte el tubo y mezcla la suspensión. Después, cúbrelo muy suavemente con 4 ml de D-PBS frío. Un gradiente claro debe ser visible (Figura 2A). Centrifugar los tubos durante 10 minutos a 3000 x g y 4 °C con aceleración máxima y sin freno. Si la separación se produce según lo previsto, se forman tres fases (Figura 2C). Aspire las dos fases superiores por completo (Figura 2C-1,2) y deséchelas. Es importante que no queden residuos de mielina (Figura 2E).NOTA: Si el gradiente no funcionó y las celdas se necesitan con urgencia, no succionar las dos fases superiores. En su lugar, llene el tubo de 15 ml con D-PBS frío hasta 15 ml e inviértalo varias veces. Centrifugar de nuevo a 1000 x g durante 10 min a 4 °C con aceleración máxima y sin freno. Chupe el sobrenadante y repita los pasos 4.1 a 4.4. Llene el tubo con D-PBS frío hasta 14 ml y ciérrelo. Invierta el tubo con fuerza en el banco de trabajo hasta que el gránulo de la celda se desprenda del fondo del tubo. No haga vórtices. Centrifugar la muestra de nuevo a 1000 x g y 4 °C durante 10 min. Ajuste la aceleración máxima y el freno completo. Aspire el sobrenadante con cuidado y por completo. Figura 2: Lo que se debe y no se debe hacer durante la remoción de escombros. (A) Ejemplo positivo para el gradiente después de superponerlo con 4 mL de PBS. La fase superior que consiste en 4 ml de PBS se distingue claramente de la fase inferior que consiste en la suspensión de la célula del SNC con la solución de eliminación de residuos. (B) Ejemplo negativo para el gradiente después de superponerlo con 4 mL de PBS. El gradiente carece de una separación clara entre el PBS y la suspensión de la celda que se encuentra debajo. Un poco del PBS se difunde en la suspensión celular. (C) Ejemplo positivo para el gradiente después de la centrifugación. Se pueden distinguir fácilmente tres fases separadas. No hay residuos de mielina visibles en la fase superior (1) o inferior (3) del gradiente. La fase media contiene toda la mielina (2). El gránulo celular es visible en la parte inferior del tubo de 15 ml. (D) Ejemplo negativo para el gradiente después de la centrifugación. No es posible una separación precisa entre las tres fases. Algunos residuos de mielina son visibles en la fase superior (1) e inferior (3) del gradiente. (E) Ejemplo positivo para el gradiente después de aspirar las dos fases superiores. La muestra resultante contiene solo el gránulo de la célula y un sobrenadante transparente arriba. No quedan residuos de mielina. (F) Ejemplo negativo para el gradiente después de aspirar las dos fases superiores. La muestra todavía contiene algunos residuos de mielina (flecha negra). Abreviaturas: SNC = sistema nervioso central; PBS = solución salina tamponada con fosfato Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 5. Extracción de glóbulos rojos (Duración: Aproximadamente 1 h dependiendo del número de suspensiones de células del SNC) NOTA: Este paso evita la contaminación posterior por los glóbulos rojos y asegura una lisis óptima de los eritrocitos con un efecto mínimo sobre los otros tipos de células aisladas del tejido del SNC. Los siguientes volúmenes están indicados para suspensiones celulares derivadas de 100 mg a 1 g de tejido neuronal correspondiente a dos cerebros y médula espinal de ratones adultos. Si trabaja con más de dos suspensiones de células del SNC, amplíe todos los reactivos y los volúmenes totales en consecuencia. Comience con la preparación de la solución de extracción de glóbulos rojos (RBCRS): por dos suspensiones de células del SNC combinadas. Diluir 100 μL de solución madre de extracción de glóbulos rojos (10x) del kit de disociación cerebral adulto en 900 μL de ddH2O para alcanzar una dilución final de 1:10. Guarde el RBCRS a 2-8 °C hasta su uso. Deseche los restos no utilizados al final del día. Resuspenda el gránulo celular de hasta dos suspensiones celulares del SNC en 1 ml de RBCRS. Evite el vórtice. Incubar la solución durante 10 min a 4 °C. Agregue 10 ml de tampón de PB frío a dos suspensiones celulares combinadas. Centrifugar la muestra a 300 x g y 4 °C durante 10 min y aspirar el sobrenadante completamente después. Vuelva a suspender cada gránulo de célula de una suspensión de células del SNC en 80 μl de tampón PB pipeteando lentamente hacia arriba y hacia abajo. En consecuencia, utilice 160 μL para resuspender los gránulos celulares derivados de dos suspensiones celulares del SNC. Cuando se trabaja con varias suspensiones celulares del SNC de la misma condición experimental, se agrupan todas estas suspensiones celulares. Determine el recuento de células, por ejemplo, utilizando una cámara de recuento mejorada. Las suspensiones celulares se diluyeron generalmente 1:50 en tampón PB, seguido de una dilución adicional de 1:10 en una solución de azul de tripano al 0,4%. 6. Protocolo de perlas magnéticas en ratones naïve y EAE (Duración: Aproximadamente 1 h) Etiquetar magnéticamente los diferentes tipos de células del SNC con MicroBeads específicas para su antígeno de superficie. A continuación, coloque la suspensión de la célula en la columna y separe magnéticamente las células etiquetadas retenidas dentro de la columna y las células no etiquetadas que la atraviesan. Después de retirar la columna del campo magnético, elimine las células marcadas magnéticamente de la columna en un tubo como la fracción de célula seleccionada positivamente.NOTA: Los volúmenes para el proceso de etiquetado magnético se calculan para un máximo de 1 x 107 celdas en total. Si se obtienen más células, amplíe todos los volúmenes totales y de reactivos en consecuencia. Se recomienda trabajar rápido y utilizar únicamente soluciones preenfriadas para evitar el taponamiento de anticuerpos en la superficie celular y el marcaje celular inespecífico, así como para garantizar una alta viabilidad de las poblaciones celulares aisladas. También es importante realizar los pasos de lavado tan pronto como el depósito de la columna esté vacío agregando el tampón de PB para que las columnas no se sequen. Divida la suspensión purificada de células del SNC sin diluir en dos fracciones para los siguientes aislamientos de microglía y oligodendrocitos. La proporción de ambas fracciones depende del recuento de células deseado de cada tipo de célula.NOTA: En la Tabla 1 se indican más detalles (duración de la incubación, pasos detallados del protocolo, volúmenes, reactivos y método de recuento de células). Tabla 1: Flujo de trabajo para el marcaje magnético simultáneo y aislamiento de oligodendrocitos y microglía de ratones naïve y EAE. Ambos tipos de células se aíslan a través de una selección positiva. Se indica que los pasos que se enumeran en la misma fila se deben realizar a la vez. Abreviaturas: CD11b = quinasa 11B dependiente de ciclina; EAE = encefalomielitis autoinmune experimental; FcR = proteína similar al receptor Fc; O4 = marcador de oligodendrocitos O4. Haga clic aquí para descargar esta tabla. 7. Modificación del protocolo: clasificación adicional para el aislamiento de microglía en ratones EAE (Duración: Aproximadamente 1,5-2 h) NOTA: Cuando se trabaja con ratones EAE, es necesario complementar el protocolo de aislamiento celular basado en MACS mediante FACS para eliminar las poblaciones de células CD11b+ distintas de la microglía (por ejemplo, monocitos, macrófagos, células asesinas naturales, granulocitos o células dendríticas) de la fracción de células CD11b+ . De lo contrario, se puede omitir este paso. Prepare la mezcla maestra de tinción que contiene 1x PBS complementado con CD11b FITC (clon M1/70, 1:50) y CD45 APC/Cy7 (clon 30-F11, 1:200). Utilice 100 μL de la mezcla maestra de tinción por cada 5 x 106 células. Evite todos los anticuerpos antes de su uso. Centrifugar la suspensión celular de la microglía a 300 x g y 4 °C durante 10 min y aspirar el sobrenadante con cuidado. Vuelva a suspender el gránulo celular con 100 μL de la mezcla maestra de tinción preparada por 5 x 106 células. Incubar durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente (RT). Detenga la reacción añadiendo 500 μL de PBS y centrifugue la muestra de nuevo a 300 x g y 4 °C durante 10 min. Aspirar el sobrenadante con cuidado y resuspender el gránulo celular con 1x PBS suplementado con 10 μg/mL de ADNasa para alcanzar una concentración final de 1 x 107 células por mL. Almacene las celdas a 4 °C hasta que comience la clasificación. Aplique la suspensión celular en un colador de 100 μm colocado en un nuevo tubo FACS inmediatamente antes de comenzar con la clasificación. Ajuste el caudal a 1000 eventos por segundo y utilice la boquilla de 100 μm. Clasifique la población celular deseadade células altas CD45intCD11b en un nuevo tubo de 15 ml preparado con 1x PBS en RT. 8. Preparación del flujo negativo de oligodendrocitos para el aislamiento de neuronas y astrocitos (Duración: Aproximadamente 1 h) NOTA: El flujo negativo de oligodendrocitos del paso 6 se recoge para su posterior aislamiento de neuronas y astrocitos. Para ello, la suspensión celular se divide en dos partes. Debido al aislamiento previo de oligodendrocitos de la suspensión celular del SNC, se minimiza la contaminación por células O4+ que de otro modo se observaría. Centrifugar el flujo negativo de los oligodendrocitos a 300 x g y 4 °C durante 10 min y aspirar el sobrenadante con cuidado. Resuspender el gránulo celular en 80 μL de tampón PB por suspensión de células del SNC agrupada previamente utilizada para el aislamiento de la fracción positiva de oligodendrocitos. Cuenta las celdas. Realice el recuento de las células que se supone que son O4- utilizando una cámara de recuento mejorada después de diluir la suspensión celular 1:50 en tampón PB seguido de una dilución adicional 1:10 en azul de tripano al 0,4%. Divida la suspensión celular purificada sin diluir en dos fracciones para el siguiente aislamiento simultáneo de neuronas y astrocitos. La proporción de ambas fracciones depende de la cantidad preferida de cada tipo de célula.NOTA: En la Tabla 2 se indican más detalles (duración de la incubación, pasos detallados del protocolo, volúmenes, reactivos y método de recuento de células). Tabla 2: Flujo de trabajo para el marcaje magnético simultáneo y aislamiento de neuronas y astrocitos de ratones naïve y EAE. Ambos tipos de células se aíslan del flujo negativo de oligodendrocitos. Los astrocitos se separan como una selección positiva a través de microesferas anti-ACSA-2, mientras que las neuronas se purifican a través de la biotinilación y el agotamiento de todas las células no neuronales como una selección negativa. Se indica que los pasos que se enumeran en la misma fila se deben realizar a la vez. Abreviaturas: Anti-ACSA-2 = antígeno 2 de la superficie de la célula de astrocitos; EAE = encefalomielitis autoinmune experimental; FcR = proteína similar al receptor Fc; MACS = clasificación de células activadas magnéticamente. Haga clic aquí para descargar esta tabla. 9. Análisis de pureza de los tipos de células residentes aisladas en el SNC (Duración: Aproximadamente 2 h) NOTA: Se recomienda realizar citometría de flujo de las cuatro poblaciones de células aisladas residentes en el SNC para medir y comparar sus purezas y viabilidad. Por lo tanto, es necesario teñir todos los tipos de células con un anticuerpo marcado con fluoróforo. La tinción de células vivas/muertas se implementa utilizando un colorante de viabilidad fijable (1:10.000). Panel de pureza – protocolo de tinción extracelularUtilice 1 x 105 células disueltas en 50 μL de PBS por tinción. Prepare la mezcla maestra de tinción disuelta en PBS con 2 % de FCS/2 mM de EDTA que consta de los siguientes anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo dirigidos a marcadores de superficie específicos del tipo de célula: CD11b FITC (clon 1/70, 1:100)25,26,27,28, Biotina-PE (clon Bio3-18E7, 1:200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (clon REA-969, 1:200)33,34,35, O4 APC (clon REA-576, 1:400) y CD45 BV510 (clon 30-F11, 1:150)36,37. Añadir 1 μg de anti-CD16/32 por cada 1 x 106 células para bloquear el receptor Fc3 8,39. Vortex todos los anticuerpos antes de su uso. Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 540 x g y 4 °C y aspirar el sobrenadante con cuidado. Vuelva a suspender el gránulo celular en 100 μL de la mezcla maestra respectiva e incube la muestra durante 15 min a RT en la oscuridad. Lavar las células con 500 μL de 1x PBS con 2% FCS/2 mM EDTA y centrifugar la muestra durante 5 min a 540 x g y 4 °C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el gránulo celular con 70 μL de PBS 1x con FCS al 2%/EDTA mM. Agite la muestra para disociar completamente el gránulo celular. Posteriormente, la muestra está lista para el análisis por citometría de flujo. Panel de pureza – protocolo de tinción intracelular con NeuNUtilice 1 x 105 células de cada población celular para la tinción intracelular de NeuN, que es un marcador nuclear específico de la neurona 40,41. Esta es una forma adicional de teñir neuronas viables. Transfiera 1 x 105 células de cada población celular a un tubo FACS. Agregue 1 ml de PBS con 2% de FCS/2 mM de EDTA por tubo. Centrifugar los tubos a 540 x g y 4 °C durante 5 min. Mientras tanto, prepare la mezcla maestra disuelta en PBS con 2% de FCS/2 mM de EDTA que consiste en los siguientes anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo dirigidos a marcadores de superficie específicos del tipo celular: CD11b FITC (clon M1/70, 1:100)25,26,27,28, Biotina-PE (clon Bio3-18E7, 1:200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (clon REA-969, 1:200)33,34,35 y CD45 BV510 (clon 30-F11, 1:150)36,37. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 100 μL de la mezcla maestra preparada e incubar la muestra durante 10 min a RT en la oscuridad. Lavar las células con 100 μL de PBS con 2% FCS/2 mM EDTA y centrifugarlas de nuevo a 540 x g y 4 °C durante 5 min. Mientras tanto, prepare 200 μL de la solución de fijación/permeabilización: Añadir 50 μL del stock concentrado de concentrado de fijación/permeabilización a 150 μL de diluyente de fijación/permeabilización para alcanzar una dilución final de 1:4. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 100 μL de solución de fijación/permeabilización 1x. Incubar la muestra durante 30 min a 4 °C. Mientras tanto, prepare 1 ml de tampón de permeabilización/lavado 1x añadiendo 100 μl de material tampón de permeabilización a 900 μl de ddH2O para alcanzar una dilución final de 1:10. Lavar las células 1 vez con 100 μL de 1 tampón de permeabilización/lavado y centrifugar la muestra a 540 x g y 4 °C durante 5 min. Mientras tanto, prepare otra mezcla maestra en 1x tampón de permeabilización/lavado que consista solo en NeuN (NeuN AF647, clon EPR12763, 1:200) y 1 μg de anti-CD16/32 por cada 106 células para bloquear el receptor Fc. Aspirar el sobrenadante. Resuspender las células fijadas y permeabilizadas en 50 μL de la segunda mezcla maestra e incubar durante 30 min a 4 °C. Lavar la muestra con 100 μL de tampón de permeabilización/lavado 1x y centrifugar a 540 x g y 4 °C durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 70 μL de PBS con FCS al 2%/2 mM de EDTA. Posteriormente, la muestra está lista para el análisis citométrico de flujo. Después de configurar el panel en el citómetro de flujo, adquiera celdas para el análisis de pureza utilizando un software de análisis de citometría de flujo. 10. Análisis estadístico Realizar análisis estadísticos y diseñar gráficos con un programa de análisis gráfico. Los datos se presentan como media ± SEM.