Isolamento simultaneo dei principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale da topi adulti con encefalomielite autoimmune

Tutti gli esperimenti EAE sono stati indotti in topi femmina C57BL/6J all’età di 10-12 settimane e approvati dalle autorità locali (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen). Anche il rispetto della legge tedesca e dell’UE sulla protezione degli animali è stato garantito in qualsiasi momento degli esperimenti. Tutti i topi sono stati tenuti in gabbie ventilate individualmente. NOTA: I seguenti volumi di reagenti si riferiscono a un cervello e a un midollo spinale murini adulti, che sono denominati sospensione di cellule del SNC nel seguente e pesano approssimativamente da circa 20 mg a 500 mg. Se è prevista la dissociazione di più di una sospensione cellulare del SNC, tutti i volumi e i materiali dei reagenti devono essere aumentati di conseguenza. Si raccomanda di conservare continuamente in ghiaccio la soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS; 1x) con calcio e magnesio, integrata con 1 g/L di glucosio e 36 mg/L di piruvato di sodio) durante l’intero esperimento. Se in seguito è prevista la coltivazione delle cellule, eseguire tutte le fasi in condizioni sterili mediante l’uso di cappe. In caso contrario, nessuna delle seguenti sezioni del protocollo deve essere eseguita sotto un cofano. Conservare i tamponi sul ghiaccio. Utilizzare solo soluzioni pre-raffreddate ed evitare il vortice durante l’intero esperimento. Vedere la Figura 1 per il flusso di lavoro generale. Figura 1: Flusso di lavoro per l’isolamento simultaneo di oligodendrociti, microglia, astrociti e neuroni in topi naïve e EAE. I primi passi del flusso di lavoro sono gli stessi sia per i topi naïve che per quelli EAE. Se si desidera lavorare con una replica EAE, l’induzione EAE deve essere eseguita in anticipo (1). In breve, il protocollo inizia con la dissezione (2) e la dissociazione (3) del cervello murino e del midollo spinale, seguita dalla rimozione dei detriti (4) e dei globuli rossi (5). Successivamente, la sospensione cellulare del SNC purificata risultante viene suddivisa in due frazioni per l’isolamento simultaneo di oligodendrociti e microglia tramite MACS (6). Le microglia vengono rilevate tramite microsfere anti-CD11b, mentre gli oligodendrociti vengono isolati utilizzando microsfere anti-O4 (selezioni positive). Dal flusso negativo degli oligodendrociti (8), gli astrociti vengono isolati tramite microsfere anti-ACSA-2 (selezione positiva) e neuroni mediante marcatura con biotina e deplezione di tutte le cellule non neuronali (selezione negativa). Nei topi EAE, l’isolamento delle cellule CD11b+ è seguito dall’ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza delle cellule CD45intCD11balte per eliminare altre cellule immunitarie CD11b+ come macrofagi, cellule dendritiche, monociti, granulociti e cellule natural killer che sono note per partecipare ai processi di neuroinfiammazione durante il corso EAE (7)27,28,48. Dopo l’isolamento dei diversi tipi di cellule residenti nel SNC, è possibile eseguire analisi di purezza (9). Abbreviazioni: Abs = anticorpi; ACSA-2 = antigene di superficie delle cellule astrocitarie-2; CD11b = chinasi ciclina-dipendente 11B; CD45 = recettore tirosin-proteina fosfatasi C; SNC = sistema nervoso centrale; EAE = encefalomielite autoimmune sperimentale; MACS = selezione cellulare ad attivazione magnetica; O4 = marcatore oligodendrocitario O4. Questa cifra è stata modificata da49. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 1. Induzione di EAE attivi Preparazione dei reagentiPer la separazione cellulare: preparare il tampone PB e conservarlo a 2-8 °C per un massimo di 1 settimana. Per preparare la soluzione madre, aggiungere 475 mL di 1x PBS senza integratori (pH 7,2) + 25 mL di albumina sierica bovina allo 0,5% (BSA). Utilizzare una diluizione 1:20 preparata in BSA. Per la citometria a flusso e lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS): preparare il tampone FACS, PBS con siero fetale di vitello (FCS) al 2% e 2 mM di EDTA e conservarlo a 2-8 °C. Per preparare, aggiungere 500 mL di 1x PBS senza supplementi e 10 mL di FCS + 2 mL di EDTA (da 0,5 M di EDTA) Eseguire l’immunizzazione secondo il protocollo di Bittner et al. 5. In breve, indurre EAE mediante iniezione sottocutanea di un’emulsione contenente 200 μg di peptide MOG35-55 e 200 μL di adiuvante di Freud completo di cui 200 μg di Mycobacterium tuberculosis. Anestetizzare il topo con isoflurano al 2% utilizzando una camera di anestesia con un vaporizzatore di isoflurano. Usa un unguento veterinario sugli occhi dell’animale per prevenire la secchezza durante l’anestesia. Dopo 2 ore, iniettare un’iniezione intraperitoneale di 100 ng di tossina pertosse (PTx) disciolta in 100 μL di PBS 1x secondo il protocollo di Huntemann et al.24. Ripetere l’iniezione di PTx il giorno 2 dopo l’immunizzazione.ATTENZIONE: Osservare ogni animale fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere il decubito sternale. I topi che hanno subito le procedure di iniezione non vengono restituiti alla compagnia degli altri topi fino a quando non si sono completamente ripresi. Per Mycobacterium tuberculosis e PTx: evitare l’inalazione, l’ingestione e il contatto con la pelle e gli occhi. Il Mycobacterium tuberculosis è un attivatore del sistema immunitario innato. Il PTx ha molti effetti biologici. Monitorare quotidianamente la progressione dell’EAE, eseguita da due ricercatori in cieco che monitorano il peso ed esaminano clinicamente i topi. A tal fine, utilizzare il seguente sistema di punteggio: grado 0 – nessun segno clinico di EAE, grado 1 – paresi parziale della coda, grado 2 – paresi completa della coda, grado 3 – debolezza moderata degli arti posteriori, grado 4 – debolezza completa degli arti posteriori e andatura atassica, grado 5 – paraparesi lieve, paraparesi di grado 6, paraparesi di grado 7, tetraparesi di grado 8, tetraparesi di grado 9, e morte di grado 10. Utilizzare i seguenti criteri di esclusione per un’ulteriore partecipazione al punteggio clinico dell’esperimento > 7 o una perdita di peso superiore al 20% del peso corporeo iniziale. Per la dissezione del cervello e del midollo spinale, sopprimere i topi EAE il giorno 16 dopo l’induzione EAE che rappresenta il massimo della malattia. 2. Preparazione del tessuto nervoso centrale (durata: circa 10 minuti per topi) Dopo aver sacrificato i topi con anidride carbonica, inizia con la perfusione transcardica di ciascun topo con 20 ml di PBS 1x. Ripetere nuovamente la perfusione con 20 mL di PBS 1x. Posizionare il mouse in posizione supina e fissare gli arti con le cannule. Applicare etanolo al 75% sulla parte anteriore del corpo dell’animale. A quel punto non sono necessarie ulteriori misure di sterilità. Apri l’addome e il torace facendo una sezione longitudinale attraverso la pelle e la fascia con l’aiuto di una forbice. Taglia le costole lateralmente e piega il torace verso l’alto per ottenere libero accesso al cuore. Fissare il torace piegato verso l’alto con le cannule. Apri l’atrio destro usando le forbici. Applicare 20 ml di PBS 1x nel ventricolo sinistro con una cannula per eliminare il sangue attraverso l’atrio destro inciso. Esporre il cranio tagliando la pelle sopra la testa murina attraverso una sezione longitudinale e spostare la pelle intorno alla testa usando una pinza. Incidere il cranio con l’aiuto di una forbice lungo la sutura sagittale. Inserire la punta di una pinza lungo la linea di incisione per aprire la calotta. Rimuovere le parti rimanenti della calotta con una pinza in modo che il cervello sia completamente esposto. Rimuovi il cervello con cura e posizionalo in una matrice cerebrale murina. Tagliate il cervello a fette sagittali spesse 1 mm usando una lametta da barba. Tagliare la colonna vertebrale con l’aiuto di una forbice appena sopra la cresta iliaca in modo che la siringa possa essere inserita nel canale spinale.NOTA: Il modo più semplice per rimuovere il midollo spinale è risciacquarlo dal canale spinale con PBS. In caso contrario, gli archi vertebrali devono essere aperti singolarmente con le forbici e quindi il midollo spinale può essere rimosso. Sciacquare il midollo spinale dal canale spinale dalla caudale al craniale utilizzando una siringa da 20 ml con un ago da 20 G contenente 1x PBS. Tagliare il midollo spinale in segmenti lunghi 0,5 cm con un bisturi. Conservare ogni sospensione di cellule del SNC costituita da cervello e midollo spinale corrispondente in una capsula di Petri separata per topo riempita con circa 3 mL di D-PBS freddo. Conservare le pietanze con ghiaccio fino a un’ulteriore lavorazione. 3. Dissociazione tissutale del SNC (Durata: circa 1-1,5 h a seconda del numero di sospensioni cellulari del SNC) NOTA: Il tessuto neurale di topi adulti viene dissociato combinando la dissociazione meccanica con la degradazione enzimatica della matrice extracellulare. In tal modo, l’integrità strutturale rimane e la sospensione cellulare può essere utilizzata per ulteriori procedure di isolamento cellulare. Preparare il volume appropriato della miscela enzimatica 1 composta da 50 μL di enzima P e 1.900 μL di tampone Z per sospensione cellulare del SNC. Entrambi i reagenti appartengono al kit di dissociazione cerebrale per adulti. Preparare il volume appropriato della miscela enzimatica 2 costituita da 10 μL di enzima A e 20 μL di tampone Y per sospensione cellulare del SNC. Entrambi i reagenti appartengono al kit di dissociazione cerebrale per adulti. Trasferire 1.950 μL di miscela enzimatica 1 nella provetta C e aggiungere successivamente i pezzi di tessuto di una sospensione cellulare del SNC. Utilizzare un tubo C per mouse. Aggiungere 30 μL di miscela enzimatica 2 a ciascuna provetta C. Chiudere bene i tubi C e fissarli capovolti sul manicotto del dissociatore di celle con riscaldatori. Eseguire il programma appropriato denominato 37C_ABDK_01 (richiede 30 minuti). Osservare almeno i primi 5 minuti del programma per assicurarsi che tutti i tubi girino alla stessa velocità. È possibile che si verifichino errori durante l’esecuzione. Quindi, vai al passaggio 6. Negli ultimi 2 minuti del programma, posizionare un colino da 70 μm su una provetta da 50 mL per ogni sospensione di cellule del SNC dissociata. Pre-inumidire questi filtri con 2 mL di D-PBS. Al termine del programma, collegare le provette C dal dissociatore e inserirle in una centrifuga. Centrifugare i campioni a 300 x g e 4 °C per 1 minuto per raccogliere il campione sul fondo della provetta. Risospendere il campione e applicarlo al colino pre-inumidito. Aggiungere 10 mL di D-PBS freddo alla provetta C vuota e chiuderla. Agitare delicatamente e applicare la sospensione sul colino corrispondente. Gettare i filtri e chiudere le provette da 50 ml. Centrifugare nuovamente la sospensione cellulare a 300 x g e 4 °C per 10 min. Successivamente, aspirare l’intero surnatante con molta attenzione. 4. Rimozione dei detriti (Durata: circa 1,5-2 ore a seconda del numero di sospensioni cellulari del SNC) NOTA: La dissociazione tissutale spesso porta a mielina e detriti cellulari che possono compromettere l’analisi a valle. Con l’aggiunta di una soluzione per la rimozione dei detriti, questi detriti possono essere rimossi in modo efficiente dalla sospensione cellulare del SNC. Risospendere accuratamente il pellet cellulare con 3.100 μL di D-PBS per ciascuna sospensione cellulare del SNC. Non vorticare. Se si lavora con più di una sospensione di cellule del SNC, raggruppare al massimo due sospensioni di cellule del SNC derivate da una condizione o da un gruppo sperimentale in una provetta da 15 mL. Aggiungere 900 μL della soluzione per la rimozione dei detriti dal kit di dissociazione cerebrale per adulti a una sospensione di cellule del SNC o 1.800 μL di soluzione per la rimozione dei detriti a due sospensioni di cellule del SNC raggruppate. Capovolgere il tubo e mescolare la sospensione. Successivamente, sovrapporlo molto delicatamente con 4 ml di D-PBS freddo. Dovrebbe essere visibile un gradiente chiaro (Figura 2A). Centrifugare le provette per 10 minuti a 3000 x g e 4 °C con la massima accelerazione e senza freno. Se la separazione avviene come previsto, si formano tre fasi (Figura 2C). Aspirare completamente le due fasi superiori (Figura 2C-1,2) ed eliminarle. È importante che non rimangano residui di mielina (Figura 2E).NOTA: Se il gradiente non ha funzionato e le celle sono necessarie urgentemente, non aspirare le due fasi superiori. Invece, riempi la provetta da 15 mL con D-PBS freddo fino a 15 mL e capovolgi più volte. Centrifugare nuovamente a 1000 x g per 10 minuti a 4 °C con la massima accelerazione e senza freno. Aspirare il surnatante e ripetere i passaggi 4.1-4.4. Riempire la provetta con D-PBS freddo fino a 14 mL e chiuderla. Capovolgere con forza il tubo sul banco di lavoro fino a quando il pellet cellulare non si stacca dal fondo del tubo. Non vorticare. Centrifugare nuovamente il campione a 1000 x g e 4 °C per 10 min. Impostare l’accelerazione completa e il freno completo. Aspirare il surnatante con cura e completamente. Figura 2: Cosa fare e cosa non fare durante la rimozione dei detriti. (A) Esempio positivo per il gradiente dopo la sovrapposizione con 4 mL di PBS. La fase superiore costituita da 4 mL di PBS è chiaramente distinguibile dalla fase inferiore costituita dalla sospensione cellulare del SNC con la soluzione di rimozione dei detriti. (B) Esempio negativo per il gradiente dopo la sovrapposizione con 4 mL di PBS. Il gradiente manca di una netta separazione tra il PBS e la sospensione cellulare sottostante. Un po’ di PBS viene diffuso nella sospensione cellulare. (C) Esempio positivo per il gradiente dopo centrifugazione. Si possono facilmente distinguere tre fasi distinte. Non sono visibili residui di mielina nella fase superiore (1) o inferiore (3) del gradiente. La fase intermedia contiene tutta la mielina (2). Il pellet cellulare è visibile sul fondo della provetta da 15 ml. (D) Esempio negativo per il gradiente dopo centrifugazione. Non è possibile una separazione accurata tra le tre fasi. Alcuni residui di mielina sono visibili nella fase superiore (1) e inferiore (3) del gradiente. (E) Esempio positivo per il gradiente dopo aver aspirato le due fasi superiori. Il campione risultante contiene solo il pellet cellulare e un surnatante trasparente sopra. Non vengono lasciati residui di mielina. (F) Esempio negativo per il gradiente dopo aver aspirato le due fasi superiori. Il campione contiene ancora alcuni residui di mielina (freccia nera). Abbreviazioni: SNC = sistema nervoso centrale; PBS = soluzione salina tamponata con fosfati Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 5. Rimozione dei globuli rossi (durata: circa 1 ora a seconda del numero di sospensioni di cellule del SNC) NOTA: Questo passaggio previene la successiva contaminazione da parte dei globuli rossi e garantisce una lisi ottimale degli eritrociti con un effetto minimo sugli altri tipi di cellule isolate dal tessuto del SNC. I seguenti volumi sono indicati per sospensioni cellulari derivate da 100 mg a 1 g di tessuto neuronale corrispondente a due cervelli di topi adulti e midollo spinale. Se si lavora con più di due sospensioni cellulari del SNC, aumentare di conseguenza tutti i reagenti e i volumi totali. Iniziare con la preparazione della soluzione per la rimozione dei globuli rossi (RBCRS): per due sospensioni di cellule del SNC raggruppate. Diluire 100 μL di soluzione madre per la rimozione dei globuli rossi (10x) dal kit di dissociazione cerebrale per adulti in 900 μL di ddH2O per ottenere una diluizione finale di 1:10. Conservare l’RBCRS a 2-8 °C fino al momento dell’uso. Scartare i resti inutilizzati alla fine della giornata. Risospendere il pellet cellulare di un massimo di due sospensioni cellulari del SNC in 1 mL dell’RBCRS. Evita il vortice. Incubare la soluzione per 10 minuti a 4 °C. Aggiungere 10 mL di tampone PB freddo a due sospensioni cellulari in pool. Centrifugare il campione a 300 x g e 4 °C per 10 minuti e successivamente aspirare completamente il surnatante. Risospendere ciascun pellet cellulare da una sospensione cellulare del SNC in 80 μL di tampone PB pipettando lentamente su e giù. Di conseguenza, utilizzare 160 μL per risospendere i pellet cellulari derivati da due sospensioni cellulari del SNC. Quando si lavora con diverse sospensioni cellulari del SNC provenienti dalla stessa condizione sperimentale, raggruppare tutte queste sospensioni cellulari. Determinare il numero di cellule, ad esempio utilizzando una camera di conteggio migliorata. Le sospensioni cellulari sono state solitamente diluite 1:50 in tampone PB, seguita da un’ulteriore diluizione di 1:10 in soluzione di blu di tripano allo 0,4%. 6. Protocollo delle biglie magnetiche in topi naïve e EAE (Durata: 1 ora circa) Etichetta magneticamente i diversi tipi di cellule del SNC con MicroBeads specifici per il loro antigene di superficie. Quindi, posizionare la sospensione cellulare nella colonna e separare magneticamente le cellule etichettate trattenute all’interno della colonna e le celle non etichettate che scorrono attraverso. Dopo aver rimosso la colonna dal campo magnetico, svuotare le cellule marcate magneticamente dalla colonna in un tubo come frazione cellulare selezionata positivamente.NOTA: I volumi per il processo di etichettatura magnetica sono calcolati per un massimo di 1 x 107 celle totali. Se si ottengono più cellule, aumentare di conseguenza tutti i reagenti e i volumi totali. Si raccomanda di lavorare rapidamente e di utilizzare solo soluzioni pre-raffreddate per prevenire il capping degli anticorpi sulla superficie cellulare e la marcatura cellulare non specifica, nonché per garantire un’elevata vitalità delle popolazioni cellulari isolate. È inoltre importante eseguire le fasi di lavaggio non appena il serbatoio della colonna è vuoto aggiungendo il tampone PB in modo che le colonne non si secchino. Dividere la sospensione cellulare del SNC purificata e non diluita in due frazioni per i seguenti isolamenti di microglia e oligodendrociti. Il rapporto di entrambe le frazioni dipende dal numero di cellule desiderato di ciascun tipo di cellula.NOTA: Ulteriori dettagli (durata dell’incubazione, fasi dettagliate del protocollo, volumi, reagenti e metodo di conta cellulare) sono indicati nella Tabella 1. Tabella 1: Flusso di lavoro per la marcatura magnetica simultanea e l’isolamento di oligodendrociti e microglia da topi naïve e EAE. Entrambi i tipi di cellule vengono isolati tramite una selezione positiva. I passaggi elencati nella stessa riga devono essere eseguiti contemporaneamente. Abbreviazioni: CD11b = chinasi ciclina-dipendente 11B; EAE = encefalomielite autoimmune sperimentale; FcR = proteina simile al recettore Fc; O4 =marcatore oligodendrocitario O4. Clicca qui per scaricare questa tabella. 7. Modifica del protocollo: selezione aggiuntiva per l’isolamento della microglia nei topi EAE (Durata: Circa 1,5-2 ore) NOTA: Quando si lavora con topi EAE, è necessario integrare il protocollo di isolamento cellulare basato su MACS con FACS per rimuovere le popolazioni di cellule CD11b+ diverse dalla microglia (ad es. monociti, macrofagi, cellule natural killer, granulociti o cellule dendritiche) dalla frazione cellulare CD11b+ . In caso contrario, questo passaggio può essere ignorato. Preparare la miscela master di colorazione contenente 1x PBS integrato da CD11b FITC (clone M1/70, 1:50) e CD45 APC/Cy7 (clone 30-F11, 1:200). Utilizzare 100 μL della miscela master di colorazione per 5 x 106 cellule. Vortex tutti gli anticorpi prima dell’uso. Centrifugare la sospensione di cellule microglia a 300 x g e 4 °C per 10 minuti e aspirare con cura il surnatante. Risospendere il pellet cellulare con 100 μL della miscela master di colorazione preparata per 5 x 106 celle. Incubare per 15 minuti al buio a temperatura ambiente (RT). Arrestare la reazione aggiungendo 500 μL di PBS e centrifugare nuovamente il campione a 300 x g e 4 °C per 10 min. Aspirare con cautela il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 1x PBS integrato da 10 μg/mL di DNAsi per raggiungere una concentrazione finale di 1 x 107 cellule per mL. Conservare le cellule a 4 °C fino all’inizio della cernita. Applicare la sospensione cellulare su un colino da 100 μm posizionato su una nuova provetta FACS immediatamente prima di iniziare la cernita. Impostare la portata a 1000 eventi al secondo e utilizzare l’ugello da 100 μm. Ordinare la popolazione cellulare desideratadi cellule alte CD45intCD11b in una nuova provetta da 15 mL preparata con 1x PBS a RT. 8. Preparazione del flusso negativo di oligodendrociti per l’isolamento di neuroni e astrociti (Durata: 1 ora circa) NOTA: Il flusso negativo degli oligodendrociti della fase 6 viene raccolto per un ulteriore isolamento di neuroni e astrociti. A tal fine, la sospensione cellulare viene divisa in due parti. A causa del precedente isolamento degli oligodendrociti dalla sospensione cellulare del SNC, la contaminazione da parte delle cellule O4+ è ridotta al minimo rispetto a quanto altrimenti si sarebbe osservato. Centrifugare il flusso negativo degli oligodendrociti a 300 x g e 4 °C per 10 minuti e aspirare accuratamente il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 80 μL di tampone PB per sospensione di cellule del SNC in pool precedentemente utilizzata per l’isolamento della frazione positiva degli oligodendrociti. Conta le celle. Eseguire il conteggio delle cellule che si presume siano O4- utilizzando una camera di conteggio migliorata dopo aver diluito la sospensione cellulare 1:50 in tampone PB seguita da un’ulteriore diluizione 1:10 in blu di tripano allo 0,4%. Dividere la sospensione cellulare purificata non diluita in due frazioni per il successivo isolamento simultaneo di neuroni e astrociti. Il rapporto di entrambe le frazioni dipende dalla quantità preferita di ciascun tipo di cellula.NOTA: Ulteriori dettagli (durata dell’incubazione, fasi dettagliate del protocollo, volumi, reagenti e metodo di conta cellulare) sono indicati nella Tabella 2. Tabella 2: Flusso di lavoro per la marcatura magnetica simultanea e l’isolamento di neuroni e astrociti da topi naïve e EAE. Entrambi i tipi di cellule sono isolati dal flusso negativo degli oligodendrociti. Gli astrociti vengono separati come una selezione positiva tramite microsfere anti-ACSA-2 mentre i neuroni vengono purificati tramite biotinilazione e deplezione di tutte le cellule non neuronali come selezione negativa. I passaggi elencati nella stessa riga devono essere eseguiti contemporaneamente. Abbreviazioni: Anti-ACSA-2 = antigene di superficie delle cellule astrocitarie-2; EAE = encefalomielite autoimmune sperimentale; FcR = proteina simile al recettore Fc; MACS = selezione cellulare attivata magneticamente. Clicca qui per scaricare questa tabella. 9. Analisi di purezza dei tipi cellulari isolati residenti nel SNC (Durata: 2 ore circa) NOTA: Si raccomanda di eseguire la citometria a flusso di tutte e quattro le popolazioni cellulari isolate residenti nel SNC per misurarne e confrontarne la purezza e la vitalità. Pertanto, è necessario colorare tutti i tipi di cellule con un anticorpo marcato con fluoroforo. La colorazione delle cellule vive/morte viene implementata utilizzando un colorante di vitalità fissabile (1:10.000). Pannello di purezza – protocollo di colorazione extracellulareUtilizzare 1 x 105 cellule disciolte in 50 μL di PBS per colorazione. Preparare la miscela master di colorazione disciolta in PBS con EDTA FCS/2 mM al 2% costituita dai seguenti anticorpi monoclonali coniugati con fluorocromo che hanno come bersaglio marcatori di superficie specifici per il tipo di cellula: CD11b FITC (clone 1/70, 1:100)25,26,27,28, Biotina-PE (clone Bio3-18E7, 1:200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (clone REA-969, 1:200)33,34,35, O4 APC (clone REA-576, 1:400) e CD45 BV510 (clone 30-F11, 1:150)36,37. Aggiungere 1 μg di anti-CD16/32 per 1 x 106 cellule per bloccare il recettore Fc3 8,39. Vortex tutti gli anticorpi prima dell’uso. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 540 x g e 4 °C e aspirare con cura il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 100 μL della rispettiva miscela principale e incubare il campione per 15 minuti a RT al buio. Lavare le cellule con 500 μL di 1x PBS con 2% FCS/2 mM EDTA e centrifugare il campione per 5 minuti a 540 x g e 4 °C. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 70 μL di 1x PBS con 2% FCS/2 mM EDTA. Vorticare il campione per dissociare completamente il pellet cellulare. Successivamente, il campione è pronto per l’analisi della citometria a flusso. Pannello di purezza – protocollo di colorazione intracellulare con NeuNUtilizzare 1 x 10-5 cellule di ciascuna popolazione cellulare per la colorazione intracellulare di NeuN, che è un marcatore nucleare neurone-specifico 40,41. Questo è un ulteriore modo per colorare i neuroni vitali. Trasferire 1 x 105 cellule di ciascuna popolazione cellulare in una provetta FACS. Aggiungere 1 mL di PBS con 2% FCS/2 mM di EDTA per provetta. Centrifugare le provette a 540 x g e 4 °C per 5 min. Nel frattempo, preparare la master mix disciolta in PBS con EDTA FCS/2 mM al 2% costituita dai seguenti anticorpi monoclonali coniugati con fluorocromo che hanno come bersaglio marcatori di superficie specifici per il tipo di cellula: CD11b FITC (clone M1/70, 1:100)25,26,27,28, Biotina-PE (clone Bio3-18E7, 1:200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (clone REA-969, 1:200)33,34,35 e CD45 BV510 (clone 30-F11, 1:150)36,37. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 100 μL della miscela master preparata e incubare il campione per 10 minuti a RT al buio. Lavare le cellule con 100 μL di PBS con EDTA al 2% FCS/2 mM e centrifugarle nuovamente a 540 x g e 4 °C per 5 min. Nel frattempo, preparare 200 μL della soluzione di fissazione/permeabilizzazione: aggiungere 50 μL della scorta concentrata di concentrato di fissazione/permeabilizzazione a 150 μL di diluente di fissazione/permeabilizzazione per ottenere una diluizione finale di 1:4. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 100 μL di soluzione di fissazione/permeabilizzazione 1x. Incubare il campione per 30 minuti a 4 °C. Nel frattempo, preparare 1 mL di tampone di permeabilizzazione/lavaggio 1x aggiungendo 100 μL del tampone di permeabilizzazione a 900 μL di ddH2O per ottenere una diluizione finale di 1:10. Lavare le cellule 1x con 100 μL di 1x tampone di permeabilizzazione/lavaggio e centrifugare il campione a 540 x g e 4 °C per 5 min. Nel frattempo, preparare un’altra miscela master in 1x tampone di permeabilizzazione/lavaggio costituito solo da NeuN (NeuN AF647, clone EPR12763, 1:200) e 1 μg di anti-CD16/32 per 106 cellule per bloccare il recettore Fc. Aspirare il surnatante. Risospendere le cellule fisse e permeabilizzate in 50 μL della seconda miscela master e incubare per 30 minuti a 4 °C. Lavare il campione con 100 μL di tampone di permeabilizzazione/lavaggio 1x e centrifugare a 540 x g e 4 °C per 5 min. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 70 μL di PBS con 2% FCS/2 mM di EDTA. Successivamente, il campione è pronto per l’analisi citofluorimetrica. Dopo aver impostato il pannello sul citometro a flusso, acquisire le cellule per l’analisi della purezza utilizzando un software di analisi della citometria a flusso. 10. Analisi statistica Esegui analisi statistiche e progetta grafici con un programma di analisi grafica. I dati sono presentati come media ± SEM.