Isolement simultané de types de cellules résidentes du système nerveux central chez des souris adultes atteintes d’encéphalomyélite auto-immune

Toutes les expériences EAE ont été induites chez des souris femelles C57BL/6J à l’âge de 10-12 semaines et approuvées par les autorités locales (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen). Le respect de la législation allemande et européenne sur la protection des animaux a également été assuré à tout moment des expériences. Toutes les souris ont été gardées dans des cages ventilées individuellement dans des conditions de logement pour animaux. REMARQUE : Les volumes de réactifs suivants se réfèrent à un cerveau et à une moelle épinière murins adultes, qui sont appelés suspension de cellules du SNC dans ce qui suit et pèsent environ 20 mg à 500 mg. Si la dissociation de plus d’une suspension de cellules du SNC est prévue, tous les volumes de réactifs et tous les matériaux doivent être mis à l’échelle en conséquence. Il est recommandé de conserver la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (D-PBS ; 1x) avec du calcium et du magnésium, complétée par 1 g/L de glucose et 36 mg/L de pyruvate de sodium) en continu sur de la glace pendant toute la durée de l’expérience. Si la culture cellulaire est prévue par la suite, effectuez toutes les étapes dans des conditions stériles en utilisant des hottes. Sinon, aucune des sections de protocole suivantes n’a besoin d’être exécutée sous un capot. Conservez les tampons sur de la glace. N’utilisez que des solutions pré-refroidies et évitez les vortex tout au long de l’expérience. Reportez-vous à la figure 1 pour connaître l’ensemble du flux de travail. Figure 1 : Flux de travail pour l’isolement simultané d’oligodendrocytes, de microglies, d’astrocytes et de neurones chez des souris naïves et EAE. Les premières étapes du flux de travail sont les mêmes pour les souris naïves et EAE. Si l’on souhaite travailler avec une répétition EAE, l’induction EAE doit être effectuée au préalable (1). En bref, le protocole commence par la dissection (2) et la dissociation (3) du cerveau et de la moelle épinière murins, suivies de l’élimination des débris (4) et des globules rouges (5). Par la suite, la suspension de cellules du SNC purifiée qui en résulte est divisée en deux fractions pour l’isolement simultané des oligodendrocytes et de la microglie via MACS (6). Les microglies sont détectées à l’aide de microbilles anti-CD11b tandis que les oligodendrocytes sont isolés à l’aide de microbilles anti-O4 (sélections positives). À partir de l’écoulement négatif des oligodendrocytes (8), les astrocytes sont isolés via des microbilles anti-ACSA-2 (sélection positive) et des neurones par marquage à la biotine et épuisement de toutes les cellules non neuronales (sélection négative). Chez les souris EAE, l’isolement des cellules CD11b+ est suivi d’un tri cellulaire activé par fluorescence des cellules CD45intCD11bélevées afin d’éliminer d’autres cellules immunitaires CD11b+ telles que les macrophages, les cellules dendritiques, les monocytes, les granulocytes et les cellules tueuses naturelles connues pour participer aux processus de neuroinflammation au cours de l’évolution de l’EAE (7)27,28,48. Après l’isolement des différents types de cellules résidentes du SNC, des analyses de pureté peuvent être effectuées (9). Abréviations : Abs = anticorps ; ACSA-2 = antigène de surface des cellules astrocytaires-2 ; CD11b = kinase 11B dépendante de la cycline ; CD45 = tyrosine-protéine phosphatase C de type récepteur ; SNC = système nerveux central ; EAE = encéphalomyélite auto-immune expérimentale ; MACS = tri cellulaire activé par magnétisme ; O4 = marqueur oligodendrocytaire O4. Ce chiffre a été modifié par rapport à49. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 1. Induction de l’EAE actif Préparation des réactifsPour la séparation cellulaire : Préparez le tampon PB et conservez-le à une température comprise entre 2 et 8 °C pendant 1 semaine maximum. Pour préparer la solution mère, ajouter 475 mL de 1x PBS sans suppléments (pH 7,2) + 25 mL d’albumine sérique bovine (BSA) à 0,5 %. Utilisez une dilution de 1 :20 préparée en BSA. Pour la cytométrie en flux et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) : Préparez le tampon FACS, PBS avec 2 % de sérum de veau fœtal (FCS) et 2 mM d’EDTA et conservez-le à une température comprise entre 2 et 8 °C. Pour préparer, ajouter 500 mL de 1x PBS sans suppléments et 10 mL de FCS + 2 mL d’EDTA (à partir de 0,5 M de stock EDTA) Effectuer l’immunisation selon le protocole de Bittner et al. 5. En bref, induire l’EAE par injection sous-cutanée d’une émulsion contenant 200 μg de peptide MOG35-55 et 200 μL d’adjuvant de Freud complet dont 200 μg de Mycobacterium tuberculosis. Anesthésiez la souris avec de l’isoflurane à 2 % à l’aide d’une chambre d’anesthésie avec un vaporisateur d’isoflurane. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux de l’animal pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Après 2 h, injecter une injection intrapéritonéale de 100 ng de toxine de la coqueluche (PTx) dissoute dans 100 μL de 1x PBS selon le protocole de Huntemann et al.24. Répétez l’injection de PTx le jour 2 après l’immunisation.ATTENTION : Observez chaque animal jusqu’à ce qu’il ait retrouvé suffisamment de conscience pour maintenir le décubitus sternal. Les souris qui ont subi les procédures d’injection ne sont pas renvoyées en compagnie des autres souris tant qu’elles ne sont pas complètement rétablies. Pour Mycobacterium tuberculosis et PTx : Éviter l’inhalation, l’ingestion et le contact avec la peau et les yeux. Mycobacterium tuberculosis est un activateur du système immunitaire inné. Le PTx a de nombreux effets biologiques. Surveiller quotidiennement la progression de l’EAE, effectuée par deux investigateurs en aveugle qui surveillent le poids et examinent cliniquement les souris. À cette fin, le système de notation suivant a été utilisé : grade 0 – aucun signe clinique d’EAE, grade 1 – parésie partielle de la queue, grade 2 – parésie complète de la queue, grade 3 – faiblesse modérée des membres postérieurs, grade 4 – faiblesse complète des membres postérieurs et démarche ataxique, grade 5 – paraparésie légère, grade 6 – paraparésie, grade 7 – paraplégie, grade 8 – tétrapparésie, grade 9 – tétraplégie, et 10e année – décès. Utilisez les critères d’exclusion suivants pour une participation ultérieure à l’expérience : score clinique > 7 ou perte de poids supérieure à 20 % du poids corporel initial. Pour la dissection du cerveau et de la moelle épinière, euthanasier les souris EAE le 16e jour après l’induction de l’EAE, ce qui représente le maximum de la maladie. 2. Préparation des tissus du SNC (durée : environ 10 min par souris) Après avoir sacrifié des souris avec du dioxyde de carbone, commencez par la perfusion transcardique de chaque souris avec 20 mL de 1x PBS. Répétez la perfusion avec 20 mL de 1x PBS. Placez la souris en décubitus dorsal et fixez les membres avec des canules. Appliquez de l’éthanol à 75 % sur le devant de l’animal. D’autres mesures de stérilité ne sont pas nécessaires à ce stade. Ouvrez l’abdomen et le thorax en faisant une coupe longitudinale à travers la peau et le fascia à l’aide d’un ciseau. Coupez les côtes latéralement et repliez le thorax pour avoir libre accès au cœur. Fixez le thorax plié vers le haut à l’aide de canules. Ouvrez l’oreillette droite à l’aide de ciseaux. Appliquer 20 mL de 1x PBS dans le ventricule gauche à l’aide d’une canule pour évacuer le sang par l’oreillette droite incisée. Exposez le crâne en coupant la peau sur le dessus de la tête murine via une section longitudinale et déplacez la peau autour de la tête à l’aide d’une pince. Inciser le crâne à l’aide d’un ciseau le long de la suture sagittale. Insérez la pointe d’une pince le long de la ligne d’incision pour ouvrir la calotte. Retirez les parties restantes de la calotte avec des pinces afin que le cerveau soit complètement exposé. Retirez le cerveau avec précaution et placez-le dans une matrice cérébrale murine. Coupez la cervelle en tranches sagittales de 1 mm d’épaisseur à l’aide d’une lame de rasoir. Coupez la colonne vertébrale à l’aide de ciseaux juste au-dessus de la crête iliaque afin que la seringue puisse être insérée dans le canal rachidien.REMARQUE : Le moyen le plus simple d’enlever la moelle épinière est de l’évacuer du canal rachidien avec du PBS. Sinon, les arcs vertébraux doivent être ouverts individuellement avec des ciseaux, puis la moelle épinière peut être retirée. Rincez la moelle épinière du canal rachidien de la caudale au crâne à l’aide d’une seringue de 20 ml avec une aiguille de 20 G contenant 1x PBS. Coupez la moelle épinière en segments de 0,5 cm de long à l’aide d’un scalpel. Conservez chaque suspension de cellules du SNC composée du cerveau et de la moelle épinière correspondante dans une boîte de Pétri distincte par souris remplie d’environ 3 mL de D-PBS froid. Conservez les plats sur de la glace jusqu’à ce qu’ils soient transformés. 3. Dissociation des tissus du SNC (Durée : environ 1 à 1,5 h selon le nombre de suspensions de cellules du SNC) REMARQUE : Le tissu neural de souris adultes est dissocié en combinant la dissociation mécanique avec la dégradation enzymatique de la matrice extracellulaire. Ainsi, l’intégrité structurelle reste et la suspension cellulaire peut être utilisée pour d’autres procédures d’isolement cellulaire. Préparer le volume approprié du mélange enzymatique 1 composé de 50 μL d’enzyme P et de 1 900 μL de tampon Z par suspension de cellules du SNC. Les deux réactifs appartiennent au kit de dissociation cérébrale adulte. Préparer le volume approprié du mélange enzymatique 2 composé de 10 μL d’enzyme A et de 20 μL de tampon Y par suspension de cellules du SNC. Les deux réactifs appartiennent au kit de dissociation cérébrale adulte. Transférez 1 950 μL du mélange enzymatique 1 dans le tube C et ajoutez ensuite les morceaux de tissu d’une suspension de cellules du SNC. Utilisez un tube C par souris. Ajouter 30 μL de mélange enzymatique 2 dans chaque tube C. Fermez hermétiquement les tubes C et fixez-les à l’envers sur le manchon du dissociateur de cellule avec des éléments chauffants. Exécutez le programme approprié nommé 37C_ABDK_01 (prend 30 min). Observez au moins les 5 premières minutes du programme pour vous assurer que tous les tubes tournent à la même vitesse. L’apparition d’erreurs pendant l’exécution est possible. Ensuite, passez à l’étape 6. Dans les 2 dernières minutes du programme, placez une crépine de 70 μm sur un tube de 50 ml pour chaque suspension de cellules dissociées du SNC. Pré-humidifiez ces passoires avec 2 mL de D-PBS. Après la fin du programme, fixez les tubes C du dissociateur et placez-les dans une centrifugeuse. Centrifuger les échantillons à 300 x g et 4 °C pendant 1 min pour prélever l’échantillon au fond du tube. Remettre l’échantillon en suspension et l’appliquer sur la passoire pré-humidifiée. Ajouter 10 mL de D-PBS froid dans le tube C vide et le fermer. Secouez-le doucement et appliquez la suspension sur la passoire correspondante. Jetez les crépines et fermez les tubes de 50 ml. Centrifuger à nouveau la suspension cellulaire à 300 x g et 4 °C pendant 10 min. Ensuite, aspirez l’ensemble du surnageant très soigneusement. 4. Enlèvement des débris (durée : environ 1,5 à 2 h selon le nombre de suspensions de cellules du SNC) REMARQUE : La dissociation tissulaire conduit souvent à la myéline et aux débris cellulaires qui peuvent nuire à l’analyse en aval. En ajoutant une solution d’élimination des débris, ces débris peuvent être efficacement éliminés de la suspension de la cellule du SNC. Remettre soigneusement la pastille cellulaire en suspension avec 3 100 μL de D-PBS pour chaque suspension de cellules du SNC. Ne pas vortex. Si vous travaillez avec plus d’une suspension de cellules du SNC, regroupez au maximum deux suspensions de cellules du SNC dérivées d’une condition ou d’un groupe expérimental dans un tube de 15 mL. Ajouter 900 μL de la solution d’élimination des débris de la trousse de dissociation cérébrale adulte à une suspension de cellules du SNC ou 1 800 μL de solution d’élimination des débris à deux suspensions de cellules du SNC regroupées. Retournez le tube et mélangez la suspension. Ensuite, recouvrez-le très doucement de 4 mL de D-PBS froid. Un dégradé clair doit être visible (figure 2A). Centrifuger les tubes pendant 10 min à 3000 x g et 4 °C avec une accélération complète et sans frein. Si la séparation se produit comme prévu, trois phases se forment (Figure 2C). Aspirez complètement les deux phases supérieures (Figure 2C-1,2) et jetez-les. Il est important qu’aucun résidu de myéline ne soit laissé (Figure 2E).REMARQUE : Si le gradient n’a pas fonctionné et que les cellules sont nécessaires de toute urgence, n’aspirez pas les deux phases supérieures. Au lieu de cela, remplissez le tube de 15 mL avec du D-PBS froid jusqu’à 15 mL et retournez-le plusieurs fois. Centrifuger à nouveau à 1000 x g pendant 10 min à 4 °C avec une accélération complète et sans frein. Aspirez le surnageant et répétez les étapes 4.1 à 4.4. Remplissez le tube de D-PBS froid jusqu’à 14 ml et fermez-le. Retournez puissamment le tube sur l’établi jusqu’à ce que la pastille de cellule se détache du fond du tube. Ne pas vortex. Centrifuger à nouveau l’échantillon à 1000 x g et 4 °C pendant 10 min. Réglez l’accélération et le freinage à fond. Aspirer le surnageant avec précaution et complètement. Figure 2 : À faire et à ne pas faire lors de l’enlèvement des débris. (A) Exemple positif pour le gradient après recouvrement avec 4 mL de PBS. La phase supérieure, constituée de 4 mL de PBS, se distingue clairement de la phase inférieure, constituée de la suspension de la cellule du SNC avec la solution d’élimination des débris. (B) Exemple négatif pour le gradient après recouvrement avec 4 mL de PBS. Le gradient n’a pas de séparation claire entre le PBS et la suspension cellulaire en dessous. Une partie du PBS est diffusée dans la suspension cellulaire. (C) Exemple positif pour le gradient après centrifugation. Trois phases distinctes peuvent être facilement distinguées. Aucun résidu de myéline n’est visible dans la phase supérieure (1) ou inférieure (3) du gradient. La phase intermédiaire contient toute la myéline (2). La pastille de cellule est visible au fond du tube de 15 mL. (D) Exemple négatif pour le gradient après centrifugation. Il n’y a pas de séparation précise possible entre les trois phases. Des résidus de myéline sont visibles dans la phase supérieure (1) et inférieure (3) du gradient. (E) Exemple positif pour le gradient après aspiration des deux phases supérieures. L’échantillon obtenu ne contient que la pastille cellulaire et un surnageant clair au-dessus. Aucun résidu de myéline n’est laissé. (F) Exemple négatif pour le gradient après aspiration des deux phases supérieures. L’échantillon contient encore des résidus de myéline (flèche noire). Abréviations : SNC = système nerveux central ; PBS = solution saline tamponnée au phosphate Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 5. Élimination des globules rouges (Durée : Environ 1 h selon le nombre de suspensions de cellules du SNC) REMARQUE : Cette étape empêche la contamination ultérieure par les globules rouges et assure une lyse optimale des érythrocytes avec un effet minimal sur les autres types de cellules isolées du tissu du SNC. Les volumes suivants sont indiqués pour les suspensions cellulaires dérivées de 100 mg à 1 g de tissu neuronal correspondant à deux cerveaux et moelles épinières de souris adultes. Si vous travaillez avec plus de deux suspensions de cellules du SNC, augmentez la taille de tous les réactifs et des volumes totaux en conséquence. Commencez par la préparation de la solution d’élimination des globules rouges (RBCRS) : par deux suspensions de cellules du SNC regroupées. Diluer 100 μL de solution mère d’élimination des globules rouges (10x) du kit de dissociation cérébrale adulte dans 900 μL de ddH2O pour obtenir une dilution finale de 1 :10. Conservez le RBCRS à une température comprise entre 2 et 8 °C jusqu’à son utilisation. Jetez les restes inutilisés à la fin de la journée. Remettre en suspension la pastille cellulaire d’un maximum de deux suspensions de cellules du SNC dans 1 mL de RBCRS. Évitez les vortex. Incuber la solution pendant 10 min à 4 °C. Ajouter 10 mL de tampon PB froid à deux suspensions cellulaires groupées. Centrifuger l’échantillon à 300 x g et 4 °C pendant 10 min et aspirer complètement le surnageant par la suite. Remettre en suspension chaque pastille cellulaire d’une suspension de cellule du SNC dans 80 μL de tampon PB en pipetant lentement de haut en bas. Par conséquent, utiliser 160 μL pour remettre en suspension des pastilles cellulaires dérivées de deux suspensions de cellules du SNC. Lorsque vous travaillez avec plusieurs suspensions de cellules du SNC provenant de la même condition expérimentale, regroupez toutes ces suspensions cellulaires. Déterminer le nombre de cellules, par exemple à l’aide d’une chambre de comptage améliorée. Les suspensions cellulaires étaient généralement diluées à 1 :50 dans un tampon PB, suivies d’une dilution supplémentaire à 1 :10 dans une solution de bleu de trypan à 0,4 %. 6. Protocole de billes magnétiques chez les souris naïves et EAE (Durée : environ 1 h) Marquez magnétiquement les différents types de cellules du SNC avec des microbilles spécifiques à leur antigène de surface. Ensuite, placez la suspension cellulaire dans la colonne et séparez magnétiquement les cellules marquées retenues dans la colonne et les cellules non étiquetées qui la traversent. Après avoir retiré la colonne du champ magnétique, rincez les cellules marquées magnétiquement de la colonne dans un tube en tant que fraction cellulaire sélectionnée positivement.REMARQUE : Les volumes pour le processus de marquage magnétique sont calculés pour un maximum de 1 x 107 cellules au total. Si vous obtenez plus de cellules, augmentez tous les volumes de réactifs et totaux en conséquence. Il est recommandé d’agir rapidement et de n’utiliser que des solutions pré-refroidies pour éviter le plafonnement des anticorps à la surface des cellules et le marquage cellulaire non spécifique, ainsi que pour assurer une viabilité élevée des populations cellulaires isolées. Il est également important d’effectuer les étapes de lavage dès que le réservoir de la colonne est vide en ajoutant le tampon PB afin que les colonnes ne se dessèchent pas. Divisez la suspension de cellules du SNC purifiée non diluée en deux fractions pour les isolements suivants de la microglie et des oligodendrocytes. Le rapport des deux fractions dépend du nombre de cellules souhaité pour chaque type de cellule.NOTA : De plus amples détails (durée de l’incubation, étapes détaillées du protocole, volumes, réactifs et méthode de numération cellulaire) sont indiqués dans le tableau 1. Tableau 1 : Flux de travail pour le marquage magnétique simultané et l’isolement des oligodendrocytes et des microglies de souris naïves et EAE. Les deux types de cellules sont isolés par une sélection positive. Les étapes répertoriées sur la même ligne sont indiquées pour être exécutées en une seule fois. Abréviations : CD11b = kinase 11B dépendante de la cycline ; EAE = encéphalomyélite auto-immune expérimentale ; FcR = protéine de type récepteur Fc ; O4 = marqueur oligodendrocytaire O4. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau. 7. Modification du protocole : tri supplémentaire pour l’isolement de la microglie chez les souris EAE (Durée : environ 1,5-2 h) REMARQUE : Lorsque l’on travaille avec des souris EAE, il est nécessaire de compléter le protocole d’isolement cellulaire basé sur MACS de FACS pour éliminer les populations de cellules CD11b+ autres que la microglie (par exemple, les monocytes, les macrophages, les cellules tueuses naturelles, les granulocytes ou les cellules dendritiques) de la fraction cellulaire CD11b+ . Dans le cas contraire, cette étape peut être ignorée. Préparer le mélange maître de coloration contenant 1x PBS complété par CD11b FITC (clone M1/70, 1 :50) et CD45 APC/Cy7 (clone 30-F11, 1 :200). Utiliser 100 μL de mélange maître de coloration par 5 x 106 cellules. Vortex tous les anticorps avant utilisation. Centrifuger la suspension de cellules microgliales à 300 x g et 4 °C pendant 10 min et aspirer le surnageant avec précaution. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec 100 μL du mélange maître de coloration préparé par 5 x 106 cellules. Incuber pendant 15 min dans l’obscurité à température ambiante (RT). Arrêtez la réaction en ajoutant 500 μL de PBS et centrifuez à nouveau l’échantillon à 300 x g et 4 °C pendant 10 min. Aspirer le surnageant avec précaution et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1x PBS complété par 10 μg/mL d’ADN pour atteindre une concentration finale de 1 x 107 cellules par mL. Conservez les cellules à 4 °C jusqu’au début du tri. Appliquer la suspension cellulaire sur une crépine de 100 μm placée sur un nouveau tube FACS immédiatement avant de commencer le tri. Réglez le débit sur 1000 événements par seconde et utilisez la buse de 100 μm. Trier la population cellulaire souhaitée de cellules CD45intCD11bélevées dans un nouveau tube de 15 mL préparé avec 1x PBS à RT. 8. Préparation de l’écoulement négatif des oligodendrocytes pour l’isolement des neurones et des astrocytes (Durée : environ 1 h) REMARQUE : Le flux négatif d’oligodendrocytes de l’étape 6 est collecté pour un isolement ultérieur des neurones et des astrocytes. À cette fin, la suspension cellulaire est divisée en deux parties. En raison de l’isolement préalable des oligodendrocytes à partir de la suspension des cellules du SNC, la contamination par les cellules O4+ est minimisée par rapport à ce qui aurait été observé autrement. Centrifuger le flux négatif des oligodendrocytes à 300 x g et 4 °C pendant 10 min et aspirer le surnageant avec précaution. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 80 μL de tampon PB par suspension cellulaire du SNC mise en commun précédemment utilisée pour l’isolement de la fraction positive des oligodendrocytes. Comptez les cellules. Effectuer le comptage des cellules supposées être O4- à l’aide d’une chambre de comptage améliorée après dilution de la suspension cellulaire 1 :50 dans un tampon PB suivi d’une dilution supplémentaire 1 :10 dans du bleu trypan à 0,4 %. Divisez la suspension cellulaire purifiée non diluée en deux fractions pour l’isolement simultané suivant des neurones et des astrocytes. Le rapport des deux fractions dépend de la quantité préférée de chaque type de cellule.NOTA : De plus amples détails (durée de l’incubation, étapes détaillées du protocole, volumes, réactifs et méthode de numération cellulaire) sont indiqués dans le tableau 2. Tableau 2 : Flux de travail pour le marquage magnétique simultané et l’isolement des neurones et des astrocytes chez les souris naïves et EAE. Les deux types de cellules sont isolés à partir du flux négatif des oligodendrocytes. Les astrocytes sont séparés par sélection positive par des microbilles anti-ACSA-2, tandis que les neurones sont purifiés par biotinylation et épuisement de toutes les cellules non neuronales par sélection négative. Les étapes répertoriées sur la même ligne sont indiquées pour être exécutées en une seule fois. Abréviations : Anti-ACSA-2 = antigène-2 de surface des cellules astrocytaires ; EAE = encéphalomyélite auto-immune expérimentale ; FcR = protéine de type récepteur Fc ; MACS = tri cellulaire activé par magnétisme. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau. 9. Analyses de pureté des types de cellules isolées résidant dans le SNC (Durée : environ 2 h) REMARQUE : Il est recommandé d’effectuer une cytométrie en flux des quatre populations cellulaires isolées résidant dans le SNC pour mesurer et comparer leur pureté et leur viabilité. Par conséquent, il est nécessaire de colorer tous les types de cellules avec un anticorps marqué au fluorophore. La coloration des cellules vivantes/mortes est mise en œuvre à l’aide d’un colorant de viabilité fixable (1 :10 000). Panel de pureté – protocole de coloration extracellulaireUtiliser 1 x 105 cellules dissoutes dans 50 μL de PBS par coloration. Préparer le mélange maître de coloration dissous dans du PBS avec 2 % de FCS/2 mM d’EDTA constitué des anticorps monoclonaux conjugués au fluorochrome suivants ciblant des marqueurs de surface spécifiques au type cellulaire : CD11b FITC (clone 1/70, 1 :100)25,26,27,28, Biotine-PE (clone Bio3-18E7, 1 :200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (clone REA-969, 1 :200)33,34,35, O4 APC (clone REA-576, 1 :400) et CD45 BV510 (clone 30-F11, 1 :150)36,37. Ajouter 1 μg d’anti-CD16/32 pour 1 x 106 cellules pour bloquer le récepteur Fc3 8,39. Vortex tous les anticorps avant utilisation. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 540 x g et 4 °C et aspirer le surnageant avec précaution. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 μL du mélange maître respectif et incuber l’échantillon pendant 15 min à RT dans l’obscurité. Laver les cellules avec 500 μL de 1x PBS avec 2% FCS/2 mM EDTA et centrifuger l’échantillon pendant 5 min à 540 x g et 4 °C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 70 μL de 1x PBS avec 2 % de FCS/2 mM d’EDTA. Vortex l’échantillon pour dissocier complètement la pastille cellulaire. Par la suite, l’échantillon est prêt pour l’analyse par cytométrie en flux. Panel de pureté – protocole de coloration intracellulaire avec NeuNUtiliser 1 x 105 cellules de chaque population cellulaire pour la coloration intracellulaire de NeuN, qui est un marqueur nucléaire spécifique des neurones 40,41. C’est un moyen supplémentaire de colorer les neurones viables. Transférez 1 x 105 cellules de chaque population cellulaire dans un tube FACS. Ajouter 1 mL de PBS avec 2 % de FCS/2 mM d’EDTA par tube. Centrifuger les tubes à 540 x g et 4 °C pendant 5 min. Dans l’intervalle, préparer le mélange maître dissous dans du PBS avec 2 % de FCS/2 mM d’EDTA composé des anticorps monoclonaux conjugués au fluorochrome suivants ciblant des marqueurs de surface spécifiques au type cellulaire : CD11b FITC (clone M1/70, 1 :100)25,26,27,28, Biotine-PE (clone Bio3-18E7, 1 :200)29,30,31,32, ACSA-2 PE-Vio615 (clone REA-969, 1 :200)33,34,35 et CD45 BV510 (clone 30-F11, 1 :150)36,37. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 μL du mélange maître préparé et incuber l’échantillon pendant 10 min à RT dans l’obscurité. Lavez les cellules avec 100 μL de PBS à 2 % de FCS/2 mM d’EDTA et centrifuez-les à nouveau à 540 x g et 4 °C pendant 5 min. Dans l’intervalle, préparer 200 μL de solution de fixation/perméabilisation : Ajouter 50 μL de la matière concentrée de concentré de fixation/perméabilisation à 150 μL de diluant de fixation/perméabilisation pour obtenir une dilution finale de 1 :4. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 100 μL de solution de fixation/perméabilisation 1x. Incuber l’échantillon pendant 30 min à 4 °C. Dans l’intervalle, préparer 1 mL de tampon de perméabilisation/lavage 1x en ajoutant 100 μL de tampon de perméabilisation à 900 μL de ddH2O pour obtenir une dilution finale de 1 :10. Laver les cellules 1x avec 100 μL de tampon de perméabilisation/lavage 1x et centrifuger l’échantillon à 540 x g et 4 °C pendant 5 min. Dans l’intervalle, préparez un autre mélange maître dans un tampon de perméabilisation/lavage 1x composé uniquement de NeuN (NeuN AF647, clone EPR12763, 1 :200) et de 1 μg d’anti-CD16/32 par 106 cellules pour bloquer le récepteur Fc. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension les cellules fixées et perméabilisées dans 50 μL du deuxième mélange maître et incuber pendant 30 min à 4 °C. Laver l’échantillon avec 100 μL de tampon de perméabilisation/lavage 1x et centrifuger à 540 x g et 4 °C pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 70 μL de PBS avec 2 % de FCS/2 mM d’EDTA. Par la suite, l’échantillon est prêt pour l’analyse par cytométrie en flux. Après avoir configuré le panneau sur le cytomètre en flux, acquérez des cellules pour l’analyse de pureté à l’aide d’un logiciel d’analyse par cytométrie en flux. 10. Analyse statistique Effectuer des analyses statistiques et concevoir des graphiques à l’aide d’un programme d’analyse graphique. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± MEB.