斑马鱼胚胎中的光遗传学信号激活

斑马鱼研究方案由美国国立卫生研究院 （National Institutes of Health） 的 NICHD 动物护理和使用委员会 （ASP 21-008） 审查和批准。所有斑马鱼研究均按照《实验动物护理和使用指南》进行。 1. 搭建灯箱 为了控制光照和温度，构建一个使用发光二极管 （LED） 微孔板照明器作为光源的灯箱（图 2A， 材料表，补充文件 1，补充文件2）。这种可定制的照明器可对多个波长进行动态、可编程的控制。注意：构建灯箱的可能策略有很多种，替代方法可能更合适（参见例如，Gerhardt 等人 51、Bugaj 等人 52、Kumar 和 Khammash53 等，参见 https://www.optobase.org/materials/）。 在灯箱中包括以下功能：温度控制（28°C是斑马鱼胚胎的理想选择），排除不需要的光（例如，室内光和阳光），均匀地传递覆盖目标区域的蓝光（例如，6孔板），以及控制光强度和曝光动态。注意：bOpto-BMP/Nodal 被蓝光激活，但一些光遗传学工具对其他波长有反应。为光遗传学工具使用适当的波长。 在培养箱顶部钻一个比 LED 输出透镜略宽的孔（图 2B）。确保培养箱顶部没有会被钻孔破坏的电气元件（材料表）。这可以通过联系孵化器制造商并直接询问来确定。 如果孵化器的顶板上有一个孔，请使用阶梯钻将孔尺寸增加到 1.25 英寸。否则，请使用带心轴的 1.25 英寸孔锯。 如果有内部面板阻挡光源，请钻出适当的孔尺寸以确保光锥不被阻挡（图 2A）。面板通常由薄金属板制成，因此请使用低速和金属钻头以防止损坏（建议使用钴钻头）。 构建一个 LED 支架以将 LED 微孔板照明器固定到培养箱的顶部（图 2C，补充文件 3、补充文件 4、补充文件 5、补充文件 6、补充文件 7、补充文件 8）。使用 M3 螺钉将四个 M3 立方体支架安装到垂直支架件上。 将两个侧支架连接到垂直支架的立方体支架的左侧和右侧。将另一个立方体支架安装到侧支架上的剩余孔上。 使用 M6 螺钉将垂直支架件安装到 LED 微孔板照明器组件（材料表）上。将 LED 透镜垫圈放在 LED 系统透镜上。 将组装好的部件安装到培养箱面板支架上，然后安装到垂直和侧面支架上的 M3 支架上。将培养箱垫圈放在培养箱顶部的钻孔上。 将培养箱面板支架放在培养箱垫圈的顶部，确保垫圈和面板开口与培养箱的孔同心。使用 8 号螺钉将面板安装到培养箱顶部。确保此密封件是不透光的。 将 6 孔板放在培养箱的顶部架子上。确定光束是否均匀地覆盖板（图2A）。使用一张纸来可视化光线覆盖。 如果整个板没有被光束覆盖，请通过向下移动搁板来增加 LED 和板之间的距离。对于此处描述的系统，LED 和搁板之间的 ~14 英寸就足够了。 使用测光表确定辐照度水平和空间均匀性（材料表）。 为避免无意中的阳光和室内光线照射，请使用挡风雨条确保培养箱门不透光（图 2A）。 斑马鱼胚胎在28°C下发育旺盛54.使用存储卡温度计确保灯箱保持 28 °C。 2. 生成注射用mRNA 注：pCS2+ 是 bOpto-BMP 构建体38 和 bOpto-Nodal 构建体39 的矢量主链。该载体对氨苄西林具有耐药性。bOpto-BMP由三种构建体组成（图1B）：BMPR1aa-LOV（Addgene#207614）：与LOV融合的I型BMPR1aa受体（也称为Alk3）的假定激酶结构域;Acvr1l-LOV （Addgene # 207615）：与 LOV 融合的 I 型 Acvr1l 受体（也称为 Alk8）的推定激酶结构域;和 BMPR2a-LOV （Addgene # 207616）：II 型 BMPR2a 受体的推定激酶结构域和以下 C 端结构域与 LOV 融合。bOpto-Nodal由两种构建体组成（图1E）：Acvr1ba-LOV：与LOV融合的I型Acvr1ba受体（也称为Acvr1b）的推定激酶结构域;Acvr2ba-LOV：II 型 Acvr2ba 受体（也称为 Acvr2b）与 LOV 融合的推定激酶结构域。 为了线性化质粒，在37°C下使用NotI限制性内切酶消化2-5μg质粒DNA，持续1-3小时（材料表）。注：也可以使用质粒作为PCR模板生成线性化DNA。 使用标准柱式纯化试剂盒（材料表）纯化DNA。 使用 体外 SP6 转录试剂盒（如 mMessage mMachine 试剂盒）从线性化模板（材料表）转录 RNA。根据制造商的建议设置两个反应，以确保更高的产量。 使用标准柱式RNA纯化试剂盒（材料表）纯化RNA。也可以通过沉淀进行净化。 3. 注射mRNA 至少在注射前 1 天，制作注射皿和琼脂糖包被的 6 孔板。在斑马鱼胚胎培养基中制备 200 mL 1% 琼脂糖，然后微波加热，直到琼脂糖完全溶解。任何标准的斑马鱼胚胎培养基都应该是可以接受的;但是，从胚胎培养基中排除亚甲蓝，因为它会影响其他应用中的下游成像。 小心地将熔融的琼脂糖倒入100mm×15mm塑料培养皿中。将盘子装满一半。 用胚胎培养基冲洗注射皿模具，然后轻轻放在熔融的琼脂糖上，确保模具和琼脂糖之间没有气泡。使用胶带在模具背面制作标签，以便于放置和取回。 模具应漂浮在熔融的琼脂糖中。如果模具下沉，小心地从熔融的琼脂糖中取出并重复步骤3.1.3。 琼脂糖凝固后，用标签轻轻去除霉菌。这可以通过将培养皿置于4°C来加速。 如果使用去皮胚胎进行免疫荧光实验，请制作琼脂糖包被的 6 孔板。 使用一次性 10 mL 塑料移液管转移足够的熔融琼脂糖以覆盖 6 孔板每个孔的底部。 将注射培养皿和6孔板储存在4°C。 它们可以立即使用或储存，直到琼脂糖变干或污染（通常为2-3周）。 如果使用去皮胚胎进行免疫荧光实验，请准备火焰玻璃移液器吸头。 将玻璃移液管的末端插入本生燃烧器火焰中并不断旋转，直到边缘光滑。去绒毛的胚胎必须舒适地穿过移液管的末端。不要让开口收缩到胚胎直径以下。 购买或拔出显微注射针（材料表）。建议在注射当天准备额外的针头，以防需要更换。 在注射前一天，根据研究所的标准操作程序（SOP）设置斑马鱼饲养员。将男性和女性分开。打开灯箱温度调节器以保持 28 °C。 为确保灯箱温度保持在 28 °C，请使用存储卡温度计（材料表）监测温度。 准备mRNA注射混合物。注入每种结构的等摩尔量。有必要根据经验确定注射量。 bOpto-BMP 转录本大小如下：Acvr1l-LOV = 2007 个核苷酸 （nt）BMPR1aa-LOV = 1983 ntBMPR2a-LOV = 3409 吨 要注射等摩尔量，注射的 Acvr1l 构建体比 BMPR1aa 多 1.01 倍;注入的 BMPR2a 构建体比 BMPR1aa 多 1.72 倍。 bOpto-Nodal 转录本大小如下：Acvr1ba-LOV 和 Acvr2ba-LOV 都是 1962 nt。 要注射等摩尔量，请注射相同量的每种构建体。 制备等摩尔进样混合物，将靶向一种通路的所有mRNA组合到一种进样混合物中。如果需要，包括酚红注射示踪剂。对于 图 4 所示的数据，使用每个 bOpto-Nodal 构建体（Acvr1ba-LOV 和 Acvr2ba-LOV）的 15 pg，对于 bOpto-BMP 使用 7.8 pg Acvr1l-LOV 和 BMPR1aa-LOV，使用 13.4 pg BMPR2a-LOV。 将进样混合物储存在-20°C。 一旦确定了注射混合物的最佳浓度，制成5-10μL等分试样并储存在-20°C或-80°C。 注射日如果进行表型分析（图3A），则根据实验室的SOP将绒毛膜直接注射到单细胞阶段的细胞中心。绒毛膜保护胚胎免受环境压力的影响，并保持裂解的胚胎。这有助于在评分过程中准确定量裂解的胚胎（图4A，B）。 如果进行免疫荧光测定（图3B），胚胎最终需要去皮细胞成像（图4C）。因此，在单细胞阶段直接注射到去皮胚胎的细胞中心（参见Rogers等人55 的去皮治疗方案）。或者，胚胎可以在固定后手动去皮，但这比用假蛋白酶去皮更麻烦。 使用火焰玻璃移液器处理去皮胚胎（步骤3.1.10）。注意不要将去皮的胚胎暴露在空气或塑料中，这会导致胚胎裂解。轻柔地处理去皮的胚胎。 准备一个额外的未注射胚胎作为替代物来评估阶段进展（参见步骤4.3.5）。确保代理胚胎来自同一组实验胚胎，以便所有胚胎同时从同一父母那里受精。这对于与阶段相关的免疫荧光测定很有用，但对于表型测定则没有必要。 使用以下条件进行表型分析和免疫荧光测定：1）非注射，未暴露，2）未注射，暴露于光线，3）注射，未暴露，4）注射，暴露于光线。每种情况至少选择30个胚胎。为了获得最佳的胚胎健康，不要在6孔板中每孔孵育超过30个胚胎。 注射后，将胚胎转移到标记的培养皿或琼脂糖包被的6孔板（用于去皮胚胎）并在28°C下孵育。 胚胎还不对光敏感。在受精后 1.5 小时 （hpf） 后将注射的胚胎视为对光敏感的胚胎。 4.光照实验 注意：暴露于辐照度为 45 W/m2 的 ~450 nm 光可稳健地激活 bOpto-BMP/Nodal，而不会产生明显的光毒性（有关测光表的信息，请参阅 材料表）。光基因激活的信号水平可以通过改变辐照度值38来调整。然而，光毒性需要在更高的辐照度下进行评估。 对时间敏感的步骤。在 4 至 16 细胞阶段，大约 1.5 hpf，去除未受精和不健康的胚胎。如有必要，重新分配以确保每个孔中的胚胎数量相同（不超过30个）。注意：在 4 到 16 细胞阶段执行此步骤很重要，因为当注射的 mRNA 被翻译成蛋白质时，胚胎会变得对光敏感。我们没有观察到胚胎在1.5 hpf之前对光有明显敏感的证据。为了尽量减少在1.5 hpf后评估胚胎时无意中的光活化，请使用红光，或用红色凝胶滤纸覆盖光源 – 包括显微镜载物台 – 阻挡LOV二聚化蓝色波长（材料表）。始终如一地评估胚胎，以确保条件和实验之间的公正分布。 对于表型测定，使用以下从1.5 hpf开始的1天光暴露方案（图3A）。将未暴露的控制板包裹在铝箔中。该板应包括未注射和注射的胚胎。确保盘子完全覆盖，并注意不要将撕裂引入箔纸。将该板放在28°C灯箱的下层架子上（图2A）。 将暴露的板放在28°C灯箱的顶部架子上（图2A）。确保盖子在培养皿上，以避免胚胎培养基蒸发。打开蓝光（45 W/m2 的辐照度强烈地激活信号）。 关闭灯箱门，避免无意中暴露在室内光线下。如果需要，在关门前在灯箱内放置一个存储卡温度计。在受精后 1 天进行表型评分之前不要打开门（dpf;参见步骤 5.1）。 对于免疫荧光测定，将胚胎暴露在蓝光下20分钟，从约40%epiboly56 （~6hpf）开始，并在光照后立即与未暴露的对照一起固定（图3B）。在 40% 表观下暴露 20 分钟可重复地激活信号传导。大约 1.5 hpf，分别用铝箔包裹暴露和未暴露的盘子。确保盘子完全覆盖，并注意不要让眼泪进入箔纸。将代理盘打开包装。将包装好的盘子和未包装的代理盘子放在28°C灯箱中（图2A）。不要打开 LED。 如果测试超过一个 mRNA 量，对于未暴露的情况，将注射不同量的胚胎分类到单个琼脂糖包被的 6 孔板中，这将有助于最大限度地减少后续固定期间的无意光照。 关闭灯箱门，避免无意中暴露在室内光线下。 在 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中将甲醛原液稀释至 4%，并将 1 mL 分装到预先标记的 2 mL 圆底微量离心管中，每种条件一管。储存在4°C。 大约 5 hpf，取出含有未注射胚胎的代理皿，并使用解剖镜评估发育阶段。代理胚胎的阶段应反映包裹培养皿中光敏胚胎的阶段。 将包裹好的盘子也取出，使所有盘子都经历相同的温度。重复直到代理胚胎达到 40% 表皮 （~6 hpf）。胚胎发生进程对温度敏感54;因此，培养皿在培养箱外的时间越长，胚胎达到 40% 表皮所需的时间就越长。 一旦代理胚胎达到40%的表观，打开暴露的培养皿并将其放在灯箱的顶部架子上（图2A）。将未暴露的盘子包裹起来，放在下层架子上。立即打开蓝灯，关上门，并将计时器设置为 20 分钟（45 W/m2 的辐照度强烈地激活信号）。 为准备注视，请尽可能多地消除室内光线（关闭百叶窗、关闭顶灯、关闭屏幕等）。确保含甲醛的试管贴有适当的标签。固定前，从4°C取出含甲醛的管子，放在灯箱旁边。 对时间和光敏感的步骤。准备好在 20 分钟的光照结束时快速移动。20 分钟后，打开灯箱门并取出未曝光的盘子。 使用火焰玻璃移液器吸头快速但轻柔地将光敏胚胎转移到准备好的4%甲醛相应管中。 尽量减少光敏胚胎的移植时间（<45秒），以避免无意中暴露在光下。确保移液器中没有气泡。暴露在空气中会破坏去皮的胚胎。 要将胚胎喷射到甲醛中，请将玻璃移液器吸头浸入甲醛中，让胚胎沉入液体中。通过将胚胎保持在尖端的末端，尽量减少转移到甲醛中的胚胎培养基的量。 胚胎移植后，将移液器放回同一孔中，上下移液以去除任何卡住的胚胎。这可以防止多种情况下的胚胎意外地进入一个管子。 立即对未暴露的未注射胚胎重复步骤4.3.11-4.3.13，然后对暴露的胚胎（注射和非注射）重复。 将固定胚胎在4°C下储存过夜。 5. 实验评价 表型评分和影像学检查在 1 dpf 下，理想情况下在 24-32 hpf 之间，从灯箱中取出胚胎以使用解剖镜评估表型并创建评分标准。这是实验终点;无意中的光活化不再是一个问题。 在胚胎中轻松评分。使用移液器或探针移动胚胎，以便从多个角度观察。经历过量BMP信号传导的胚胎将以不同程度的严重程度进行腹侧化，如Kishimoto等人所详细描述的那样。199746 （图4A，左图）。经历过多淋巴结信号转导的胚胎将具有一系列与过多的中胚层相关的发育缺陷（图4A，右图）1,3,47,57,58,59,60。它们通常会裂解 1 dpf。 在所有条件下对每个胚胎进行评分（图4B）。获取每个孔中所有胚胎的概览图像。如果需要，在甲基纤维素中对单个代表性胚胎进行去皮化和成像（图4A）。 免疫荧光染色和成像将胚胎在4°C的4%甲醛中孵育过夜后，除去甲醛并用1x磷酸盐缓冲盐水和吐温20（PBST）洗涤3-5x。除去PBST，加入100%甲醇。 关闭试管并轻轻倒置它们以混合残留的PBST和甲醇。用甲醇洗涤2x，并在-20°C下储存至少2小时长达数年。 对于pSmad1/5/9（BMP）免疫荧光方案，参见Rogers等人38。对于 pSmad2/3（节点）免疫荧光方案，参见 van Boxtel 等人 17 和 Rogers 等人 47。 使用能够进行光学切片的显微镜（例如，共聚焦或光片显微镜）对免疫染色的胚胎进行成像。避免饱和，并在用相同抗体染色的所有样品之间保持相同的成像条件。 完成免疫荧光染色后 5 天内的图像，因为荧光可能会随着时间的推移而消退。