Дрозофила является хорошо зарекомендовавшей себя моделью для изучения ключевых молекул, регулирующих миогенез. Однако существующих методов недостаточно для определения транскрипционной динамики мРНК и пространственного распределения в синцитии. Чтобы устранить это ограничение, мы оптимизировали метод флуоресценции РНК in situ , позволяющий обнаруживать и количественно определять мРНК в масштабе одной молекулы.
Скелетные мышцы представляют собой большие синцитии, состоящие из множества пучков миоволокон, которые вырабатывают силы и обеспечивают движение тела. Дрозофила является классической моделью для изучения биологии мышц. Сочетание генетики дрозофилы и передовых омиксных подходов привело к идентификации ключевых консервативных молекул, которые регулируют морфогенез и регенерацию мышц. Однако транскрипционная динамика этих молекул и пространственное распределение их матричной РНК в синцитии не могут быть оценены обычными методами. Здесь мы оптимизировали существующий метод флуоресценции одномолекулярной РНК in situ (smFISH), чтобы обеспечить обнаружение и количественное определение отдельных молекул мРНК в летных мышцах взрослых особей и их мышечных стволовых клетках. В качестве доказательства концепции мы проанализировали экспрессию мРНК и распределение двух эволюционно консервативных транскрипционных факторов, Mef2 и Zfh1/Zeb. Мы показываем, что этот метод может эффективно обнаруживать и количественно определять одиночные молекулы мРНК как для транскриптов в мышечных клетках-предшественниках, так и во взрослых мышцах и мышечных стволовых клетках.
Скелетные мышцы взрослого человека состоят из дифференцированных многоядерных миоволокон, сократительные свойства которых порождают движения. Мышечный рост, поддержание и регенерация зависят от мышечных предшественников и мышечных стволовых клеток (MuSC), которые определяются во время эмбрионального развития1. Миогенная программа тонко контролируется набором основных миогенных транскрипционных факторов (ТФ) (например, Pax3/7, MYOD, Mef2 и ZEB)2,3,4. Расшифровка молекулярных механизмов, регулирующих мышечную биологию, важна для выяснения фундаментальных вопросов, связанных с миологией, и для возможного терапевтического использования в лечении мышечно-дегенеративных заболеваний.
Дрозофила имеет долгую историю в качестве генетической модели для изучения миогенеза5. Недавно он появился в качестве новой модели для исследования регенерации мышц 6,7,8. Мышечная структура и основные миогенные программы у мух и млекопитающих очень консервативны. Например, ТФ Mef2 и Zfh1/ZEB выполняют консервативную функцию в регуляции развития и регенерации мышц 3,9,10,11. Мышцы взрослой дрозофилы, такие как мышцы непрямого полета (IFM), формируются из специфической популяции MuSC, известных как взрослые мышечные предшественники (AMP)12. Эти АМПБ определяются во время эмбриогенеза и связываются с эпителиальными структурами, такими как диски крыльев и ног. На протяжении эмбриональной и личиночной стадий АМП остаются недифференцированными до метаморфоза, когда они вступают в дифференцировку и слияние с образованием IFM13,14. TF Spalt major (spalt, salm) экспрессируется во время развития летных мышц и необходим для определения их структурной идентичности15. Mef2 является еще одним важным миогенным ТФ, который необходим для формирования мышц у взрослых 16,17. Он экспрессируется в AMP и поддерживается во взрослых IFM10,18. В то время как большинство АМП дифференцируются в функциональные мышцы, часть из них избегает дифференцировки и образует взрослые MuSC11. Как и у позвоночных, TF Zfh1/ZEB необходим для предотвращения преждевременной дифференцировки взрослых MuSC и поддержания их стволовости 9,10.
Доказано, что динамика экспрессии генов регулирует различные мышечные биологические процессы19,20. Появление высокопроизводительных методов секвенирования одноклеточных и одноядерных РНК позволило всесторонне исследовать эту транскрипционную динамику21,22. Одним из заметных ограничений этих подходов является их неспособность обеспечить пространственное распределение молекул мРНК в многоядерных мышечных волокнах. Эти особенности могут быть исследованы с помощью одномолекулярной флуоресцентной гибридизации in situ (smFISH), которая выявляет два типа мРНК-тел: 1. отдельные молекулы мРНК, распространяющиеся в цитоплазме и представляющие зрелую РНК и 2. Зарождающемуся транскрипту соответствуют максимум два ярких ядерных очага, в которых обнаруживаются транскрипционно активные аллели23. Таким образом, smFISH является методом выбора для количественной оценки отдельных молекул мРНК, исследования их пространственного распределения и получения моментальных снимков транскрипционной динамики генов.
Метод smFISH основан на наборе коротких флуоресцентных олигонуклеотидных зондов, специально разработанных для того, чтобы быть комплементарными к целевому транскрипту. При отжиге генерируются точечные источники высокой интенсивности, позволяющие обнаруживать мРНК на уровне одной молекулы с помощью конфокальной микроскопии24. Этот метод все чаще применяется для широкого спектра типов клеток, включая мышечные ткани млекопитающих19,20. Тем не менее, у дрозофилы, как и у других животных моделей, большая часть знаний об экспрессии генов взрослых мышц получена из объемных молекулярных анализов, в которых отсутствует количественная информация о пространственном расположении молекул мРНК. В данной работе мы оптимизировали метод выполнения smFISH на мышечных клетках-предшественниках и мышцах взрослых дрозофил 23,25. Этот протокол включает в себя полностью автоматизированный конвейер анализа для сегментации ядер, подсчета и локализации мРНК.
Применение метода smFISH приобрело популярность в последнее время, его использование распространяется на различные типы клеток и модельные организмы. Однако в случае с дрозофилой большая часть знаний об экспрессии генов взрослых мышц получена из объемных молекулярных анализов, которые не дают количественной информации о точном пространственном расположении молекул мРНК. Чтобы восполнить этот пробел, мы оптимизировали метод выполнения smFISH на мышечных клетках-предшественниках и мышцах взрослых дрозофил. Этот подход был адаптирован из ранее опубликованного протокола23 и оптимизирован для мышечных тканей дрозофилы .
Основным препятствием для получения высококачественных изображений smFISH является толщина мышц взрослого человека, которая препятствует оптимальному проникновению зондов. Поэтому крайне важно отделить мышцы взрослой особи от других тканей животного и провести процесс гибридизации с легким перемешиванием. Именно этот этап обеспечивает эффективную пермеабилизацию тканей.
Еще один важный аспект заключается в том, что отношение сигнал/шум может привести к сбою вычислительного конвейера в обнаружении определенных пятен мРНК. Мы обнаружили, что увеличение отношения сигнал/шум может быть достигнуто путем нахождения оптимальной концентрации зондов. Оптимальное разведение может отличаться в зависимости от состава каждого набора зондов, включая конъюгированный краситель и олигонуклеотидный состав. Мы рекомендуем попробовать разные разведения; Окончательное разбавление 200 нМ дало наилучшее соотношение сигнал/шум для взрослых тканей в этих экспериментах.
С помощью метода smFISH можно количественно оценить количество вновь синтезированных РНК в очагах ТС. Когда ген активно транскрибируется, в ТС одновременно продуцируются несколько зарождающихся РНК. В результате интенсивность ТС превзойдет интенсивность зрелой цитоплазматической РНК, и эта особенность в сочетании с ее ядерной локализацией может дифференцировать ТС от отдельных цитоплазматических РНК. В контексте биологии мышц обнаружение и количественная оценка TS особенно важны для определения синхронизации транскрипции специфического гена между мышечными ядрами в пределах одного синцития. Однако этот вычислительный конвейер не предназначен для дифференциации цитоплазматических мРНК и TS-сигналов. В качестве альтернативы мы предлагаем комбинировать этот метод smFISH с другими хорошо зарекомендовавшими себя инструментами анализа smFISH, такими как BayFISH или FISH-quant29,30. Было доказано, что эти инструменты облегчают автоматизированную сегментацию и расчет интенсивности флуоресценции агрегатов РНК с замечательной точностью.
Наконец, несмотря на то, что smFISH обнаруживает молекулы мРНК с высоким пространственным разрешением, он ограничен одновременным анализом небольшого количества мРНК. Многомасштабные методы, такие как merFISH (мультиплексная флуоресцентная гибридизация in situ ), позволяют проводить одновременный анализ большого количества различных мРНК31. Комбинируя олигонуклеотидные зонды и коды, исправляющие ошибки, этот метод облегчает обнаружение сотен видов РНК в отдельных клетках.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Алена Винсента за критическое прочтение рукописи. Мы благодарим Рут Леманн (Ruth Lehmann) за предоставление антител к Zfh1. Мы выражаем признательность Стефани Дутертре (Stephanie Dutertre) и Ксавье Пинсону (Xavier Pinson) за помощь в проведении конфокальной микроскопии на платформе МРической визуализации. EL поддерживается докторской стипендией от ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique. АН проводится при поддержке AFM-Telethon Ph.D. fellowship 23846. TP финансируется за счет гранта DAF Chan Zuckerberg Initiative для T.P. (2019-198009). HB поддерживается CNRS, программой Atip Avenir и грантом AFM-Telethon на батуте 23108.
Confocal microscope SP8 | Leica | SP8 DMI 6000 | |
DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
Double-sided tape | Tesa | 57910-00000 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Formaldehyde 16% | Euromedex | EM-15710 | |
Mef2 antibody | DHSB | NA | |
PBS 10x | Euromedex | ET330 | |
RNaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | |
Stellaris probes | LGC | NA | |
Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer | LGC | SMF-HB1-10 | |
Stellaris RNA FISH Wash Buffer A | LGC | SMF-WA1-60 | |
Stellaris RNA FISH Wash Buffer B | LGC | SMF-WB1-20 | |
Swann-Morton Blades | Fisher scientific | 0210 | |
ThermoMixer | Eppendorf | 5382000015 | |
Triton X-100 | Euromedex | 2000 | |
UAS-mCD8::GFP line | Bloomington | RRID:BDSC_5137 | |
Ultrapure water | Sigma-Aldrich | 95284 | |
Watch Glass, Square, 1 5/8 in | Carolina | 742300 | |
Zfh1 antibody | Gifted by Ruth Leahman | ||
Zfh1-Gal4 | Bloomington | BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625 |