ショウジョウバエの1分子スケールでの筋肉転写ダイナミクスの研究

1.翼椎間板と成体筋肉の解剖と準備 注:解剖ベンチとすべての解剖装置をRNAse阻害剤溶液でクリーンアップします(材料表)。実験用手袋は、実験手順全体を通して着用する必要があります。 ウィングディスク L3段階の幼虫を冷たい1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に入れます(図1A)。 幼虫を1x PBSで3回すすぎ、この溶液に5分間入れます。 2対の鋭い鉗子を使用して、幼虫を前部から保持し、残りの体組織(約2/3)を引っ張って廃棄します。 幼虫の最初の1/3を1対の鉗子で保持し、もう1対の鉗子で口フックを保持します。幼虫の内側の口のフックを完全に反転するまで引っ込めます。注:分析に十分なサンプルサイズを確保するために、実験ごとに約30匹の幼虫を解剖します。 翼の円盤は、幼虫の両側に沿って走る気管の2つの主要な枝と密接に関連していることを観察します。 他のすべての幼虫成分(脚椎間板と脳)を取り除き、気管に一対の翼椎間板が取り付けられたきれいな倒立幼虫の死骸を得ます(図1B)。 サンプルを 1 mL 遠心チューブに入れ、1x PBS で希釈した 4% パラホルムアルデヒド(PFA)に浸し、室温で 45 分間撹拌しながら固定します。注:サンプルの攪拌は、振動攪拌機(材料表)によって行われます。 サンプルを70%エタノール(EtOH、RNAseフリー水で希釈)で3 x 5分間洗浄し、同じ洗浄液中で4°Cで少なくとも2日間、最大1週間保存します。 間接飛行筋 成虫のハエをCO2 フライパッドで麻酔し、頭、腹部、脚、翼を取り除きます。 解剖した胸部を冷たい1x PBSに入れ、すべてのサンプルが解剖されるまでこれを続けます(図1D)。 胸部を4%PFA(1%トリトン)で室温で20分間攪拌下でプレフィクスします。 サンプルを1x PBT洗浄液(1x PBS中の1%Triton)で3 x 5分間すすぎます。 スライドガラスの両面テープ(材料表)に胸部を配置し、鋭利なミクロトームブレードで二等分して2つの半胸部を作製します(図1E、F)。 撹拌しながら、サンプルを4%PFA(1%トリトン)で室温で45分間固定します。 撹拌下で室温で1x PBT洗浄液(1% Triton、1x PBS)で2 x 20分間洗浄します。 半胸部を冷たい1x PBSに入れ、鉗子を使用してIFMを半胸部から静かに分離します(図1G)。注意: これを実現するには、キューティクルをできるだけ完全に取り除くことが重要です。 サンプルを透過処理するには、単離したIFMを70%EtOH溶液中で4°Cで少なくとも2日間、最大1週間保存します。注:実験ごとに約10の胸部からIFMを分離し、分析に適切なサンプルサイズを確保します。 2. ハイブリダイゼーション、免疫染色、およびマウント 注:同様のハイブリダイゼーション手順は、ウィングディスクとIFMサンプルの両方に適用されます。ハイブリダイゼーションを開始する前に、幼虫の死骸から翼板を分離し、200 μLのバッファーAに入れることが重要です。 プローブを 400 μL の TE バッファー(10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 8.0)に再懸濁し、最終ストック溶液を 12.5 μM にします。 サンプルをバッファーA(材料表)を含む0.5 mL遠心チューブに移します。注:容器の容積を減らすことで、サンプルを視覚化しやすくなり、洗浄プロセス中にサンプルが失われるのを防ぎます。 サンプルをバッファーAで2 x 20分間洗浄します。 バッファーAを吸引し、400 μLのハイブリダイゼーションバッファーと交換し(材料表)、サーマルミキサーで37°Cで30分間サンプルをプレハイブリダイズします(材料表)。 プローブをハイブリダイゼーションバッファーで最終濃度125 nM(翼椎間板用)、成体用筋肉(成体用筋肉)200 nMに希釈し、一次抗体を添加します。注:抗体の希釈率は、使用する特定の抗体によって異なります(材料表)。抗体の追加は任意です。ユーザーは、タンパク質の染色を中止し、代わりに抗体の添加を含まない同様のsmFISHプロトコルを使用することを選択できます。 ハイブリダイゼーションバッファーを吸引し、プローブおよび抗体を含む100μLのハイブリダイゼーションバッファーと交換する。 サンプルを37°Cの暗所で、サーマルミキサーで300rpmの撹拌下で少なくとも16時間インキュベートします。 バッファー A のアリコートを 37 °C でウォームアップします。 300rpmの撹拌下で37°Cのサーマルミキサーでサンプルを3 x 10分間洗浄します。 最後の洗浄では、二次抗体(1/200)とDAPI(1/10,000)をバッファーAで希釈し、この溶液中でサンプルを37°Cで少なくとも1時間インキュベートします。 サンプルをバッファーB(材料表)で3 x 20分間洗浄します。 サンプルを顕微鏡スライドに慎重に移し、残留バッファーBを拭き取り、30 μLの封入剤を加え、18 x 18 mmのカバーガラスで覆います。マニキュアを使用して準備を密封します。 サンプルを4°Cで最大1週間保存します。注意: ただし、プローブ信号の劣化を避けるために、できるだけ早くイメージングを実行することをお勧めします。 3. イメージング 40倍および63倍の油浸対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用して、xyz取得モードで画像を取得します(材料表)。smFISH信号は、光子計数モードを介してHyD検出器によって検出されます。 DAPI信号とUVランプを使用してサンプルを見つけます。 翼椎間板に関連する筋前駆細胞とIFM(図2 および 図3)を画像化するには、レーザーラインと発光フィルターに次の設定を適用します。 DAPI (励起(例) 405 nm、発光(em))を選択します。 450 nm)、 Alexa Fluor 488 (例: 496 nm, em. 519 nm)、smFISHプローブ用の Quasar 670 (例: 647 nm、em. 670 nm)です。 成体MuSCを画像化するには(図2D)、レーザーラインと発光フィルターに以下の設定を適用します。 DAPI (例: 405 nm、em. 450 nm)、 Alexa Fluor 488 (例: 496 nm, em. 519 nm)、 Alexa Fluor 555 (ex. 555 nm, em. 565 nm)、smFISHプローブ用の Quasar 670 (例: 647 nm、em. 670 nm)です。注:イメージングでは、二次抗体やプローブに関連する色素に応じて波長を調整することができます。 共焦点画像を として保存します。TIFFファイル。 4. 画像解析後 開始するには、ImageJ を起動し、[ プラグイン ] メニューに移動します。そこから、[ マクロ] |[編集 ] をクリックして、マクロのソース コードを開きます。注:これにより、必要に応じてパラメータを調整し、必要に応じて、マクロのソースコード内の各チャネルのフォルダディレクトリを変更できます。 このプロトコルに従い、幼虫の Mef2 smFISHスポットを定量するには、 Log_radius = 3.0およびLog_quality = 20.0の設定を使用します。Segement Mef2陽性核で、 blur = 2、nucleus_scale_parameter = 30、nucleus_threshold = -8.0、nucleus_size = 300。 筋線維では、次のパラメータを使用します: Log_radius = 2.5;Log_quality = 60.0;ぼかし = 2;nucleus_scale_parameter = 100;nucleus_threshold = 0.0;nucleus_size = 300 です。 マクロを開始するには、runコマンドを実行し、マクロが指定されたフォルダーからすべての画像を自動的にロードし、順番に定量化するのを待ちます。注:このプロセスの所要時間は、分析するデータの量に応じて、数秒から数時間までさまざまであることに注意してください。 file_FISH_results と file_nuclei_results という 2 つの新しい.csvファイルに表示される結果を探します。1つ目は、転写スポットの数と、それらの平均強度と最大強度を示しています。2つ目は、核の総数と各核内のスポットの数の両方を示します。