חקר דינמיקת שעתוק שרירים בסקאלות של מולקולות בודדות בדרוזופילה
Summary
דרוזופילה היא מודל מבוסס היטב לחקר מולקולות מפתח המווסתות מיוגנזה. עם זאת, השיטות הנוכחיות אינן מספיקות כדי לקבוע דינמיקת שעתוק mRNA והתפלגות מרחבית בתוך סינציטיה. כדי להתמודד עם מגבלה זו, ביצענו אופטימיזציה של שיטת הכלאה פלואורסצנטית באתרה של RNA המאפשרת זיהוי וכימות של mRNA בקנה מידה של מולקולה אחת.
Abstract
שרירי השלד הם סינסיטיה גדולה המורכבת ממיופיבים צרורים רבים המייצרים כוחות ומאפשרים תנועת גוף. דרוזופילה היא מודל קלאסי לחקר ביולוגיה של שרירים. השילוב של גנטיקה של דרוזופילה וגישות אומיקה מתקדמות הוביל לזיהוי מולקולות מפתח שמורות המווסתות מורפוגנזה והתחדשות שרירים. עם זאת, דינמיקת השעתוק של מולקולות אלה וההתפלגות המרחבית של הרנ”א השליח שלהן בתוך הסינקיטיה אינן ניתנות להערכה בשיטות קונבנציונליות. כאן ביצענו אופטימיזציה של שיטת הכלאה קיימת של RNA פלואורסצנטי באתרו (smFISH) של מולקולה בודדת כדי לאפשר זיהוי וכימות של מולקולות mRNA בודדות בתוך שרירי תעופה בוגרים ותאי גזע השריר שלהם. כהוכחת היתכנות, ניתחנו את ביטוי ה-mRNA ואת התפלגות שני גורמי שעתוק אבולוציוניים שמורים, Mef2 ו-Zfh1/Zeb. אנו מראים כי שיטה זו יכולה לזהות ולכמת ביעילות מולקולות mRNA בודדות עבור שני התעתיקים בתאים מקדימים של שריר, שרירים בוגרים ותאי גזע שריר.
Introduction
שרירי השלד הבוגרים עשויים מסיבים מרובי גרעינים מובחנים שתכונות ההתכווצות שלהם מייצרות תנועות. גדילה, תחזוקה והתחדשות שרירים מסתמכים על אבות שריר ותאי גזע שריריים (MuSCs) המוגדרים במהלך ההתפתחות העוברית1. התוכנית המיוגנית נשלטת היטב על ידי קבוצה של גורמי שעתוק מיוגני ליבה (TFs) (למשל, Pax3/7, MYOD, Mef2 ו- ZEB)2,3,4. פענוח המנגנונים המולקולריים המווסתים את הביולוגיה של השרירים חשוב להבהרת שאלות יסוד הקשורות למיולוגיה ולשימוש טיפולי אפשרי בטיפול במחלות ניווניות שרירים.
לדרוזופילה יש היסטוריה ארוכה כמודל גנטי לחקר מיוגנזה5. לאחרונה הוא התגלה כמודל חדש לחקר התחדשות שרירים 6,7,8. מבנה השרירים ותוכניות הליבה המיוגניות נשמרים מאוד בין זבובים ליונקים. לדוגמה, ל-TFs Mef2 ו-Zfh1/ZEB יש תפקיד שמור בוויסות התפתחות והתחדשות שרירים 3,9,10,11. שרירי דרוזופילה בוגרים, כגון שרירי הטיסה העקיפה (IFMs), נוצרים מאוכלוסייה ספציפית של MuSCs, המכונים אבות שרירים בוגרים (AMPs)12. AMPs אלה מוגדרים במהלך האמבריוגנזה וקשורים למבני אפיתל כגון דיסקים בכנף וברגליים. לאורך כל שלבי העובר והזחל, AMPs נשארים בלתי ממוינים עד למטמורפוזה כאשר הם עוסקים בהתמיינות ואיחוי ליצירת IFMs13,14. TF Spalt major (spalt, salm) מתבטא במהלך התפתחות שרירי הטיסה ויש צורך לקבוע את זהותם המבנית15. Mef2 הוא TF מיוגני חשוב נוסף החיוני ליצירת שרירים בוגרים16,17. זה בא לידי ביטוי AMPs ונשמר במבוגרים IFMs10,18. בעוד שרוב ה-AMPs מתמיינים לשרירים פונקציונליים, תת-קבוצה חומקת מהתמיינות ויוצרת את MuSCs11 הבוגרים. בדומה לבעלי חוליות, TF Zfh1/ZEB נדרש כדי למנוע התמיינות מוקדמת של MuSCs בוגרים ולשמור על גזעם 9,10.
דינמיקה של ביטוי גנים הוכחה כמווסתת תהליכים ביולוגיים שונים של שרירים19,20. הופעתן של טכניקות ריצוף RNA חד-תאי וחד-גרעיני בתפוקה גבוהה אפשרה חקירה מקיפה של דינמיקות שעתוק אלה21,22. מגבלה בולטת אחת של גישות אלה היא חוסר יכולתן לספק את הפיזור המרחבי של מולקולות mRNA בסיבי השריר מרובי הגרעין. תכונות אלה יכולות להיחקר על ידי הכלאה פלואורסצנטית באתרו של מולקולה בודדת (smFISH) החושפת שני סוגים של גופי mRNA: 1. מולקולות mRNA בודדות המפוזרות בציטופלסמה ומייצגות את הרנ”א הבוגר ו-2. שני מוקדים גרעיניים בהירים לכל היותר תואמים את התעתיק המתהווה וחושפים את האללים הפעילים בשעתוק23. לכן, smFISH היא שיטה מועדפת לכימות מולקולות mRNA בודדות, החוקרת את ההתפלגות המרחבית שלהן ומספקת תמונות של דינמיקת השעתוק של הגנים.
שיטת smFISH מסתמכת על סדרה של בדיקות אוליגונוקלאוטיד פלואורסצנטיות קצרות שתוכננו במיוחד כדי להיות משלימות את תעתיק המטרה. עם החישול, הוא מייצר מקורות נקודתיים בעוצמה גבוהה המאפשרים זיהוי של mRNA ברמת מולקולה בודדת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי24. שיטה זו מיושמת יותר ויותר עבור מגוון רחב של סוגי תאים, כולל רקמות שריר יונקים19,20. עם זאת, בדרוזופילה, כמו במודלים אחרים של בעלי חיים, רוב הידע על ביטוי גנים של שרירים בוגרים נגזר מבדיקות מולקולריות בתפזורת, אשר חסרות מידע כמותי על המיקום המרחבי של מולקולות mRNA. כאן ביצענו אופטימיזציה של שיטה לביצוע smFISH על תאים מבשרי שריר ושרירי דרוזופילה בוגרים23,25. פרוטוקול זה כולל צינור ניתוח אוטומטי לחלוטין עבור סגמנטציה של גרעינים וספירת mRNA ולוקליזציה.
Protocol
Representative Results
Discussion
היישום של שיטת smFISH צבר פופולריות בתקופה האחרונה, כאשר השימוש בו משתרע על סוגי תאים שונים ואורגניזמים מודל. עם זאת, במקרה של דרוזופילה, רוב הידע על ביטוי גנים של שרירים בוגרים נגזר מבדיקות מולקולריות בתפזורת, שאינן מספקות מידע כמותי על המיקום המרחבי המדויק של מולקולות mRNA. כדי להתמודד עם פער זה, ביצענו אופטימיזציה של שיטה לביצוע smFISH על תאים מקדימים של שריר ושרירי דרוזופילה בוגרים. גישה זו הותאמה מפרוטוקול23 שפורסם בעבר והותאמה לרקמות שריר דרוזופילה .
המכשול העיקרי בהשגת תמונות smFISH באיכות גבוהה הוא עובי השרירים הבוגרים, המעכב את החדירה האופטימלית של הבדיקות. לכן, חשוב להפריד את השרירים הבוגרים משאר רקמות החיה ולבצע את תהליך ההכלאה עם תסיסה קלה. שלב מסוים זה מבטיח חלחול יעיל של הרקמות.
היבט קריטי נוסף הוא שיחס אות לרעש יכול לגרום לצנרת החישובית להיכשל באיתור כתמי mRNA מסוימים. מצאנו כי הגדלת יחס האות לרעש יכולה להיות מושגת על ידי מציאת הריכוז האופטימלי של גשושיות. הדילול האופטימלי עשוי להשתנות בהתאם להרכב של כל קבוצת בדיקה, כולל צבע מצומד והרכב אוליגונוקלאוטידים. אנו ממליצים לנסות דילולים שונים; דילול סופי של 200 ננומטר הניב את יחס האות לרעש הטוב ביותר עבור רקמות בוגרות בניסויים אלה.
בשיטת smFISH ניתן לכמת את מספר הרנ”א המסונתז החדש במוקדי TS. כאשר גן משועתק באופן פעיל, מספר רנ”א מתהווה מיוצרים בו זמנית ב-TS. כתוצאה מכך, עוצמת ה-TS תעלה על זו של רנ”א ציטופלזמי בוגר, ותכונה זו, בשילוב עם הלוקליזציה הגרעינית שלו, יכולה להבדיל בין ה-TS לבין רנ”א ציטופלזמי בודד. בהקשר של ביולוגיה של שרירים, זיהוי וכימות TS חשובים במיוחד לקביעת הסנכרון של שעתוק של גן מסוים בין גרעיני שריר בתוך אותו סינציטיום. עם זאת, צינור חישובי זה אינו מתוכנן להבדיל בין mRNA ציטופלזמי לבין אותות TS. כחלופה, אנו מציעים לשלב שיטת smFISH זו עם כלי ניתוח smFISH מבוססים אחרים, כגון BayFISH או FISH-quant29,30. כלים אלה הוכחו כמאפשרים סגמנטציה אוטומטית וחישובי עוצמת פלואורסצנטיות של צברי RNA בדיוק יוצא דופן.
לבסוף, בעוד smFISH מזהה מולקולות mRNA עם רזולוציה מרחבית גבוהה, הוא מוגבל לניתוח מספר קטן של mRNA בו זמנית. שיטות רב-ממדיות כמו merFISH (multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization) מאפשרות ניתוח סימולטני של מספר רב של mRNA31 שונים. על ידי שילוב של בדיקות אוליגונוקלאוטידים וקודים לתיקון שגיאות, שיטה זו מאפשרת זיהוי של מאות מיני RNA בתאים בודדים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאלן וינסנט על קריאתו הביקורתית של כתב היד. אנו מודים לרות להמן על מתן הנוגדן Zfh1. אנו מודים על עזרתם של סטפני דוטרטר וחאווייר פינסון למיקרוסקופ קונפוקלי בפלטפורמת ההדמיה MRic. EL נתמכת על ידי מלגת דוקטורט מטעם ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique. NA נתמך על ידי AFM-Telethon Ph.D. fellowship 23846. TP ממומן על ידי מענק DAF של יוזמת צוקרברג ל- T.P. (2019-198009). HB נתמך על ידי CNRS, תוכנית Atip Avenir ומענק הטרמפולינה AFM-Telethon 23108.
Materials
| Confocal microscope SP8 | Leica | SP8 DMI 6000 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Double-sided tape | Tesa | 57910-00000 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Formaldehyde 16% | Euromedex | EM-15710 | |
| Mef2 antibody | DHSB | NA | |
| PBS 10x | Euromedex | ET330 | |
| RNaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | |
| Stellaris probes | LGC | NA | |
| Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer | LGC | SMF-HB1-10 | |
| Stellaris RNA FISH Wash Buffer A | LGC | SMF-WA1-60 | |
| Stellaris RNA FISH Wash Buffer B | LGC | SMF-WB1-20 | |
| Swann-Morton Blades | Fisher scientific | 0210 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Triton X-100 | Euromedex | 2000 | |
| UAS-mCD8::GFP line | Bloomington | RRID:BDSC_5137 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | 95284 | |
| Watch Glass, Square, 1 5/8 in | Carolina | 742300 | |
| Zfh1 antibody | Gifted by Ruth Leahman | ||
| Zfh1-Gal4 | Bloomington | BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625 |
References
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
- Taylor, M. V., Hughes, S. M. Mef2 and the skeletal muscle differentiation program. Seminars in Cell and Developmental Biology. 72, 33-44 (2017).
- Siles, L., et al. ZEB1 imposes a temporary stage-dependent inhibition of muscle gene expression and differentiation via CtBP-mediated transcriptional repression. Molecular and Cellular Biology. 33 (7), 1368-1382 (2013).
- Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
- Boukhatmi, H. Drosophila, an integrative model to study the features of musclestem cells in development and regeneration. Cells. 10 (8), 2112 (2021).
- Bothe, I., Baylies, M. K. Drosophila myogenesis. Current Biology. 26 (17), R786-R791 (2016).
- Catalani, E., et al. RACK1 is evolutionary conserved in satellite stem cell activation and adult skeletal muscle regeneration. Cell Death Discovery. 8 (1), 459 (2022).
- Siles, L., Ninfali, C., Cortes, M., Darling, D. S., Postigo, A. ZEB1 protects skeletal muscle from damage and is required for its regeneration. Nature Communications. 10 (1), 1364 (2019).
- Boukhatmi, H., Bray, S. A population of adult satellite-like cells in Drosophila is maintained through a switch in RNA-isoforms. Elife. 7, e35954 (2018).
- Chaturvedi, D., Reichert, H., Gunage, R. D., VijayRaghavan, K. Identification and functional characterization of muscle satellite cells in Drosophila. Elife. 6, e30107 (2017).
- Gunage, R. D., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Identification of a new stem cell population that generates Drosophila flight muscles. Elife. 3, e03126 (2014).
- Figeac, N., Daczewska, M., Marcelle, C., Jagla, K. Muscle stem cells and model systems for their investigation. Developmental Dynamics. 236 (12), 3332-3342 (2007).
- Aradhya, R., Zmojdzian, M., Da Ponte, J. P., Jagla, K. Muscle niche-driven insulin-Notch-Myc cascade reactivates dormant adult muscle precursors in Drosophila. Elife. 4, e08497 (2015).
- Schonbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
- Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila. Developmental Biology. 361 (2), 191-207 (2012).
- Soler, C., Han, J., Taylor, M. V. The conserved transcription factor Mef2 has multiple roles in adult Drosophila musculature formation. Development. 139 (7), 1270-1275 (2012).
- Soler, C., Taylor, M. V. The Him gene inhibits the development of Drosophila flight muscles during metamorphosis. Mechanisms of Development. 126 (7), 595-603 (2009).
- Pinheiro, H., et al. mRNA distribution in skeletal muscle is associated with mRNA size. Journal of Cell Science. 134 (14), jcs256388 (2021).
- Denes, L. T., Kelley, C. P., Wang, E. T. Microtubule-based transport is essential to distribute RNA and nascent protein in skeletal muscle. Nature Communications. 12 (1), 6079 (2021).
- Li, H., et al. Fly Cell Atlas: A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult fruit fly. Science. 375 (6584), eabk2432 (2022).
- Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protocols. 2 (3), 100694 (2021).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods in Enzymology. 472, 365-386 (2010).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
- Mueller, F., et al. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nature Methods. 10 (4), 277-278 (2013).
- Gomez-Schiavon, M., Chen, L. F., West, A. E., Buchler, N. E. BayFish: Bayesian inference of transcription dynamics from population snapshots of single-molecule RNA FISH in single cells. Genome Biology. 18 (1), 164 (2017).
- Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).
