研究果蝇单分子尺度的肌肉转录动力学

1.翼盘和成人肌肉解剖和准备 注意：用RNAse抑制剂溶液（材料表）清理解剖台和所有解剖仪器。在整个实验过程中应佩戴实验室手套。 翼盘 将L3分期幼虫置于冷的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中（图1A）。 用1x PBS冲洗幼虫3次，并将它们保持在该溶液中5分钟。 使用两对锋利的镊子，从前部握住幼虫，拉动并丢弃其余的身体组织（约2/3）。 用一对镊子握住幼虫的前 1/3，用另一对镊子握住嘴钩。缩回幼虫内部的嘴钩，直到它完全倒置。注意：每次实验解剖大约 30 只幼虫，以确保有足够的样本量进行分析。 观察翅盘与气管的两个主要分支密切相关，它们沿着幼虫的每一侧延伸。 去除所有其他幼虫成分（腿盘和大脑），以获得干净的倒置幼虫尸体，并将一对翼盘连接到气管（图1B）。 将样品置于 1 mL 离心管中，并将它们固定在 4% 多聚甲醛 （PFA） 中，在室温下搅拌以 1x PBS 稀释 45 分钟。注：样品搅拌是通过振荡搅拌器实现的（材料表）。 用70%乙醇（EtOH，在无RNAse的水中稀释）洗涤样品3 x 5分钟，并将它们储存在4°C的同一洗涤溶液中至少2天至1周。 间接飞行肌肉 在 CO2 苍蝇垫上麻醉成年苍蝇并去除头部、腹部、腿部和翅膀。 将解剖的胸部置于冷的1x PBS中，并继续这样做，直到解剖所有样品（图1D）。 在室温下搅拌20分钟，在4%PFA（1%Triton）中前缀胸部。 用 1x PBT 洗涤液（1% Triton 溶于 1x PBS 溶液）冲洗样品 3 x 5 分钟。 将胸部放置在载玻片上的双面胶带（材料表）上，并用锋利的切片片将它们一分为二，以产生两个半胸腔（图1E，F）。 在室温下搅拌，将样品固定在4%PFA（1%Triton）中45分钟。 在室温下搅拌用1x PBT洗涤溶液（1%Triton，1x PBS）洗涤2 x 20分钟。 将半胸廓置于冷的1x PBS中，并使用镊子轻轻地将IFM与半胸廓隔离（图1G）。注意： 为此，重要的是要尽可能彻底地去除角质层。 为了透化样品，将分离的IFM储存在70%EtOH溶液中至少2天，在4°C下最多1周。注意：每次实验将IFM从大约10个胸部中分离出来，以确保有足够的样本量进行分析。 2. 杂交、免疫染色和封片 注意：类似的杂交程序适用于机翼盘和 IFM 样品。在开始杂交之前，将翅盘与幼虫尸体分离并将它们放入 200 μL 缓冲液 A 中至关重要。 将探针重悬于 400 μL TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0）中，以获得 12.5 μM 的最终储备溶液。 将样品转移到含有缓冲液A（材料表）的0.5mL离心管中。注意：通过减小容器的体积，可以更容易地可视化样品并避免在洗涤过程中丢失样品。 用缓冲液 A 洗涤样品 2 x 20 分钟。 吸出缓冲液A，用400μL杂交缓冲液（材料表）代替，并在热混合器（材料表）中在37°C下预杂交样品30分钟。 在杂交缓冲液中将探针稀释至翅盘的终浓度为125nM，成人肌肉的终浓度为200nM，并加入一抗。注：抗体稀释度因所使用的特异性抗体而异（材料表）。添加抗体是可选的。用户可以选择放弃蛋白质染色，而是使用类似的smFISH方案，该方案不包括添加抗体。 吸出杂交缓冲液，并用含有探针和抗体的 100 μL 杂交缓冲液代替。 将样品在37°C的黑暗中在300rpm搅拌下在热混合器中孵育至少16小时。 在37°C下预热缓冲液A的等分试样。 在37°C的热混合器中，在300rpm的搅拌下洗涤样品3×10分钟。 在最后一次洗涤期间，在缓冲液A中稀释二抗（1/200）和DAPI（1/10,000），并将样品在37°C下在该溶液中孵育至少1小时。 用缓冲液B（材料表）洗涤样品3 x 20分钟。 小心地将样品转移到显微镜载玻片上，擦去残留的缓冲液B，加入30μL封固剂，并用18×18mm盖玻片盖住。使用指甲油密封制剂。 将样品在4°C下储存长达1周。注意： 但是，建议尽快进行成像，以避免探头信号衰减。 3. 影像学检查 使用配备 40x 和 63x 油浸物镜的共聚焦显微镜（材料表）使用 xyz 采集模式采集图像。smFISH信号由HyD探测器通过光子计数模式检测。 使用DAPI信号和UV灯定位样品。 要对翼盘相关肌肉祖细胞和IFM（图2 和 图3）进行成像，请对激光线和发射滤光片应用以下设置：选择 DAPI （激发（例如） 405nm，发射（em.） 450 nm）、 Alexa Fluor 488 （例如 496 nm、em. 519 nm）和用于smFISH探针的 Quasar 670 （例如 647 nm，em. 670 nm）。 要对成年MuSC进行成像（图2D），请对激光线和发射滤光片应用以下设置：选择 DAPI （例如 405nm，em。 450 nm）、 Alexa Fluor 488 （例如 496 nm、em. 519 nm）、 Alexa Fluor 555 （例如 555 nm、em. 565 nm）和用于smFISH探针的 Quasar 670 （例如 647 nm，em. 670 nm）。注：对于成像，波长可以根据与二抗和探针相关的染料进行调整。 将共聚焦图像另存为 。TIFF 文件。 4. 成像后分析 首先，启动 ImageJ 并导航到 “插件” 菜单。从那里，选择 “宏”|”编辑 以打开宏源代码。注意：这将允许根据需要调整参数，如果需要，可以修改宏源代码中每个通道的文件夹目录。 要遵循此方案并定量幼虫中的 Mef2 smFISH斑点，请使用以下设置： Log_radius = 3.0和Log_quality = 20.0。Segement Mef2 阳性核， 模糊 = 2;nucleus_scale_parameter = 30;nucleus_threshold = -8.0;nucleus_size = 300。 在肌肉纤维中，使用以下参数： Log_radius = 2.5;Log_quality = 60.0;模糊 = 2;nucleus_scale_parameter = 100;nucleus_threshold = 0.0;nucleus_size = 300。 要启动宏，只需执行 run 命令并等待宏自动从指定文件夹加载所有图像并按顺序量化它们。注意：请注意，此过程的持续时间可能从几秒钟到几个小时不等，具体取决于所分析的数据量。 查找两个新.csv文件中显示的结果：file_FISH_results 和 file_nuclei_results。第一个显示转录点的数量及其平均和最大强度。第二个给出了原子核的总数和每个原子核内的斑点数量。