دراسة ديناميكا نسخ العضلات على مقاييس أحادية الجزيء في ذبابة الفاكهة
Summary
ذبابة الفاكهة هي نموذج راسخ لدراسة الجزيئات الرئيسية التي تنظم تكوين العضلات. ومع ذلك ، فإن الطرق الحالية غير كافية لتحديد ديناميكيات نسخ mRNA والتوزيع المكاني داخل الخلايا المخلية. لمعالجة هذا القيد ، قمنا بتحسين طريقة تهجين مضان الحمض النووي الريبي في الموقع مما يسمح باكتشاف وقياس mRNAs على نطاق جزيء واحد.
Abstract
العضلات الهيكلية هي خلايا تخليقية كبيرة تتكون من العديد من الألياف العضلية المجمعة التي تنتج قوى وتمكن من حركة الجسم. ذبابة الفاكهة هي نموذج كلاسيكي لدراسة بيولوجيا العضلات. أدى الجمع بين كل من علم الوراثة ذبابة الفاكهة ونهج omics المتقدمة إلى تحديد الجزيئات المحفوظة الرئيسية التي تنظم تكوين العضلات وتجديدها. ومع ذلك ، لا يمكن تقييم ديناميكيات النسخ لهذه الجزيئات والتوزيع المكاني للحمض النووي الريبي الرسول داخل المخلوي بالطرق التقليدية. هنا قمنا بتحسين طريقة مضان الحمض النووي الريبي أحادي الجزيء في الموقع (smFISH) لتمكين اكتشاف وقياس جزيئات mRNA الفردية داخل عضلات الطيران البالغة وخلاياها الجذعية العضلية. كدليل على المفهوم ، قمنا بتحليل تعبير mRNA وتوزيع عاملين للنسخ المحفوظ التطوري ، Mef2 و Zfh1 / Zeb. لقد أوضحنا أن هذه الطريقة يمكنها اكتشاف جزيئات mRNA المفردة وتحديدها بكفاءة لكل من النسخ في الخلايا السليفة العضلية والعضلات البالغة والخلايا الجذعية العضلية.
Introduction
تتكون العضلات الهيكلية البالغة من ألياف عضلية متمايزة متعددة النوى تولد خواصها المقلصة حركات. يعتمد نمو العضلات وصيانتها وتجديدها على أسلاف العضلات والخلايا الجذعية العضلية (MuSCs) التي يتم تحديدها أثناء التطور الجنيني1. يتم التحكم في البرنامج العضلي بدقة من خلال مجموعة من عوامل النسخ العضلية الأساسية (TFs) (على سبيل المثال ، Pax3 / 7 و MYOD و Mef2 و ZEB) 2،3،4. يعد فك رموز الآليات الجزيئية التي تنظم بيولوجيا العضلات أمرا مهما لتوضيح الأسئلة الأساسية المتعلقة بعلم العضلات وللاستخدام العلاجي المحتمل في علاج الأمراض التنكسية العضلية.
ذبابة الفاكهة لها تاريخ طويل كنموذج وراثي لدراسة تكوين العضلات5. وقد ظهر مؤخرا كنموذج جديد للتحقيق في تجديد العضلات6،7،8. يتم الحفاظ على بنية العضلات والبرامج العضلية الأساسية بشكل كبير بين الذباب والثدييات. على سبيل المثال ، TFs Mef2 و Zfh1 / ZEB لها وظيفة محفوظة في تنظيم نمو العضلات وتجديدها3،9،10،11. تتشكل عضلات ذبابة الفاكهة البالغة ، مثل عضلات الطيران غير المباشرة (IFMs) ، من مجموعة محددة من MuSCs ، والمعروفة باسم أسلاف العضلات البالغة (AMPs) 12. يتم تحديد AMPs هذه أثناء التطور الجنيني وترتبط بالهياكل الظهارية مثل أقراص الجناح والساق. طوال المراحل الجنينية واليرقية ، تظل AMPs غير متمايزة حتى التحول عندما تنخرط في التمايز والاندماج لتشكيل IFMs13,14. يتم التعبير عن TF Spalt Major (spalt ، salm) أثناء تطوير عضلات الطيران وهو ضروري لتحديد هويتها الهيكلية15. Mef2 هو TF مهم آخر ضروري لتكوين العضلات البالغة16,17. يتم التعبير عنها في AMPs ويتم الحفاظ عليها في IFMsللبالغين 10,18. في حين أن غالبية AMPs تتمايز إلى عضلات وظيفية ، فإن مجموعة فرعية تفلت من التمايز وتشكل MuSCsالبالغة 11. على غرار الفقاريات ، فإن TF Zfh1 / ZEB مطلوب لمنع التمايز المبكر ل MuSCs البالغة والحفاظ على جذعها 9,10.
ثبت أن ديناميكيات التعبير الجيني تنظم العمليات البيولوجية المختلفة للعضلات 19,20. مكن ظهور تقنيات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادية الخلية والنوى المفردة عالية الإنتاجية من استكشاف شامل لديناميكيات النسخ هذه21,22. أحد القيود الملحوظة لهذه الأساليب هو عدم قدرتها على توفير التوزيع المكاني لجزيئات mRNA في ألياف العضلات متعددة النوى. يمكن التحقق من هذه الميزات عن طريق التهجين الفلوري أحادي الجزيء في الموقع (smFISH) الذي يكشف عن نوعين من أجسام mRNA: 1. جزيئات mRNA الفردية المنتشرة في السيتوبلازم وتمثل الحمض النووي الريبي الناضج و 2. تتوافق بؤرتان نوويتان ساطعتان كحد أقصى مع النسخة الوليدة وتكشف عن الأليلات النشطة نسخيا23. لذلك ، فإن smFISH هي طريقة مفضلة لقياس جزيء mRNA الفردي ، والتحقيق في توزيعها المكاني وتقديم لقطات لديناميكيات النسخ الجيني.
تعتمد طريقة smFISH على مجموعة من مجسات قليل النوكليوتيد الفلورية القصيرة المصممة خصيصا لتكون مكملة للنسخة المستهدفة. عند التلدين ، فإنه يولد مصادر نقطية عالية الكثافة تسمح باكتشاف mRNA على مستوى جزيء واحد باستخدام المجهر متحد البؤر24. يتم تطبيق هذه الطريقة بشكل متزايد على مجموعة واسعة من أنواع الخلايا ، بما في ذلك أنسجة عضلات الثدييات19,20. ومع ذلك ، في ذبابة الفاكهة مثل النماذج الحيوانية الأخرى ، فإن معظم المعرفة حول التعبير الجيني للعضلات البالغة مستمدة من المقايسات الجزيئية السائبة ، والتي تفتقر إلى المعلومات الكمية حول الموقع المكاني لجزيئات mRNA. هنا قمنا بتحسين طريقة لأداء smFISH على خلايا سلائف العضلات وعضلات ذبابة الفاكهة البالغة23,25. يتضمن هذا البروتوكول خط أنابيب تحليل مؤتمت بالكامل لتجزئة النوى وعد وتوطين mRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
اكتسب تطبيق طريقة smFISH شعبية في الآونة الأخيرة ، مع امتداد استخدامها إلى أنواع مختلفة من الخلايا والكائنات الحية النموذجية. ومع ذلك ، في حالة ذبابة الفاكهة ، فإن غالبية المعرفة حول التعبير الجيني للعضلات البالغة مستمدة من المقايسات الجزيئية السائبة ، والتي تفشل في توفير معلومات كمية عن الموقع المكاني الدقيق لجزيئات mRNA. لمعالجة هذه الفجوة ، قمنا بتحسين طريقة لأداء smFISH على خلايا سلائف العضلات وعضلات ذبابة الفاكهة البالغة. تم تكييف هذا النهج من البروتوكول23 المنشور سابقا وتم تحسينه لأنسجة عضلات ذبابة الفاكهة .
العقبة الرئيسية في الحصول على صور smFISH عالية الجودة هي سمك عضلات البالغين ، مما يعيق الاختراق الأمثل للمجسات. لذلك ، من الأهمية بمكان فصل العضلات البالغة عن الأنسجة الأخرى للحيوان وتنفيذ عملية التهجين بإثارة خفيفة. هذه الخطوة بالذات تضمن نفاذية فعالة للأنسجة.
جانب آخر مهم هو أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء يمكن أن تتسبب في فشل خط الأنابيب الحسابي في اكتشاف بعض بقع mRNA. وجدنا أنه يمكن تحقيق زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء من خلال إيجاد التركيز الأمثل للمجسات. قد يختلف التخفيف الأمثل اعتمادا على تكوين كل مجموعة مسبار ، بما في ذلك الصبغة المترافقة وتكوين قليل النوكليوتيد. نوصي بتجربة تخفيفات مختلفة. أسفر التخفيف النهائي البالغ 200 نانومتر عن أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء للأنسجة البالغة في هذه التجارب.
باستخدام طريقة smFISH ، من الممكن تحديد عدد الحمض النووي الريبي المركب حديثا في بؤر TS. عندما يتم نسخ الجين بنشاط ، يتم إنتاج العديد من الحمض النووي الريبي الوليد بشكل متزامن في TS. نتيجة لذلك ، ستتجاوز شدة TS كثافة الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي الناضج ، وهذه الميزة ، جنبا إلى جنب مع توطينها النووي ، يمكن أن تميز TS عن الحمض النووي الريبي السيتوبلازمي الفردي. في سياق بيولوجيا العضلات ، يعد اكتشاف TS والقياس الكمي مهمين بشكل خاص لتحديد تزامن نسخ جين معين بين نوى العضلات داخل نفس المخلية. ومع ذلك ، لم يتم تصميم خط الأنابيب الحسابي هذا للتمييز بين إشارات mRNA السيتوبلازمية و TS. كبديل ، نقترح الجمع بين طريقة smFISH هذه وأدوات تحليل smFISH الراسخة الأخرى ، مثل BayFISH أو FISH-quant29,30. وقد ثبت أن هذه الأدوات تسهل التجزئة الآلية وحسابات شدة التألق لمجاميع الحمض النووي الريبي بدقة ملحوظة.
أخيرا ، بينما يكتشف smFISH جزيئات mRNA بدقة مكانية عالية ، فإنه يقتصر على تحليل عدد صغير من mRNA في نفس الوقت. تتيح الطرق متعددة المقاييس مثل merFISH (التألق متعدد الأخطاء القوي في الموقع التهجين) التحليل المتزامن لعدد كبير من mRNA31 المختلفة. من خلال الجمع بين مجسات قليل النوكليوتيد ورموز تصحيح الأخطاء ، تسهل هذه الطريقة اكتشاف مئات أنواع الحمض النووي الريبي في خلايا مفردة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر آلان فنسنت على قراءته النقدية للمخطوطة. نشكر روث ليمان على توفير الجسم المضاد Zfh1. نحن نعترف بمساعدة ستيفاني دوتيرتر وكزافييه بينسون للفحص المجهري متحد البؤر في منصة التصوير بالرنين المغناطيسي. يتم دعم EL من قبل زمالة الدكتوراه من وزارة التعليم العالي والبحث العلمي. يتم دعم NA من قبل AFM-Telethon Ph.D. زمالة 23846. يتم تمويل TP من خلال منحة مبادرة Chan Zuckerberg DAF إلى TP (2019-198009). يتم دعم HB من قبل CNRS ، وبرنامج Atip Avenir ، ومنحة الترامبولين AFM-Telethon 23108.
Materials
| Confocal microscope SP8 | Leica | SP8 DMI 6000 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Double-sided tape | Tesa | 57910-00000 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Formaldehyde 16% | Euromedex | EM-15710 | |
| Mef2 antibody | DHSB | NA | |
| PBS 10x | Euromedex | ET330 | |
| RNaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | |
| Stellaris probes | LGC | NA | |
| Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer | LGC | SMF-HB1-10 | |
| Stellaris RNA FISH Wash Buffer A | LGC | SMF-WA1-60 | |
| Stellaris RNA FISH Wash Buffer B | LGC | SMF-WB1-20 | |
| Swann-Morton Blades | Fisher scientific | 0210 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Triton X-100 | Euromedex | 2000 | |
| UAS-mCD8::GFP line | Bloomington | RRID:BDSC_5137 | |
| Ultrapure water | Sigma-Aldrich | 95284 | |
| Watch Glass, Square, 1 5/8 in | Carolina | 742300 | |
| Zfh1 antibody | Gifted by Ruth Leahman | ||
| Zfh1-Gal4 | Bloomington | BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625 |
References
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Chal, J., Pourquie, O. Making muscle: skeletal myogenesis in vivo and in vitro. Development. 144 (12), 2104-2122 (2017).
- Taylor, M. V., Hughes, S. M. Mef2 and the skeletal muscle differentiation program. Seminars in Cell and Developmental Biology. 72, 33-44 (2017).
- Siles, L., et al. ZEB1 imposes a temporary stage-dependent inhibition of muscle gene expression and differentiation via CtBP-mediated transcriptional repression. Molecular and Cellular Biology. 33 (7), 1368-1382 (2013).
- Weitkunat, M., Schnorrer, F. A guide to study Drosophila muscle biology. Methods. 68 (1), 2-14 (2014).
- Boukhatmi, H. Drosophila, an integrative model to study the features of musclestem cells in development and regeneration. Cells. 10 (8), 2112 (2021).
- Bothe, I., Baylies, M. K. Drosophila myogenesis. Current Biology. 26 (17), R786-R791 (2016).
- Catalani, E., et al. RACK1 is evolutionary conserved in satellite stem cell activation and adult skeletal muscle regeneration. Cell Death Discovery. 8 (1), 459 (2022).
- Siles, L., Ninfali, C., Cortes, M., Darling, D. S., Postigo, A. ZEB1 protects skeletal muscle from damage and is required for its regeneration. Nature Communications. 10 (1), 1364 (2019).
- Boukhatmi, H., Bray, S. A population of adult satellite-like cells in Drosophila is maintained through a switch in RNA-isoforms. Elife. 7, e35954 (2018).
- Chaturvedi, D., Reichert, H., Gunage, R. D., VijayRaghavan, K. Identification and functional characterization of muscle satellite cells in Drosophila. Elife. 6, e30107 (2017).
- Gunage, R. D., Reichert, H., VijayRaghavan, K. Identification of a new stem cell population that generates Drosophila flight muscles. Elife. 3, e03126 (2014).
- Figeac, N., Daczewska, M., Marcelle, C., Jagla, K. Muscle stem cells and model systems for their investigation. Developmental Dynamics. 236 (12), 3332-3342 (2007).
- Aradhya, R., Zmojdzian, M., Da Ponte, J. P., Jagla, K. Muscle niche-driven insulin-Notch-Myc cascade reactivates dormant adult muscle precursors in Drosophila. Elife. 4, e08497 (2015).
- Schonbauer, C., et al. Spalt mediates an evolutionarily conserved switch to fibrillar muscle fate in insects. Nature. 479 (7373), 406-409 (2011).
- Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila. Developmental Biology. 361 (2), 191-207 (2012).
- Soler, C., Han, J., Taylor, M. V. The conserved transcription factor Mef2 has multiple roles in adult Drosophila musculature formation. Development. 139 (7), 1270-1275 (2012).
- Soler, C., Taylor, M. V. The Him gene inhibits the development of Drosophila flight muscles during metamorphosis. Mechanisms of Development. 126 (7), 595-603 (2009).
- Pinheiro, H., et al. mRNA distribution in skeletal muscle is associated with mRNA size. Journal of Cell Science. 134 (14), jcs256388 (2021).
- Denes, L. T., Kelley, C. P., Wang, E. T. Microtubule-based transport is essential to distribute RNA and nascent protein in skeletal muscle. Nature Communications. 12 (1), 6079 (2021).
- Li, H., et al. Fly Cell Atlas: A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult fruit fly. Science. 375 (6584), eabk2432 (2022).
- Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protocols. 2 (3), 100694 (2021).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods in Enzymology. 472, 365-386 (2010).
- Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
- Mueller, F., et al. FISH-quant: automatic counting of transcripts in 3D FISH images. Nature Methods. 10 (4), 277-278 (2013).
- Gomez-Schiavon, M., Chen, L. F., West, A. E., Buchler, N. E. BayFish: Bayesian inference of transcription dynamics from population snapshots of single-molecule RNA FISH in single cells. Genome Biology. 18 (1), 164 (2017).
- Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).
