電気刺激フラットマウント網膜におけるカルシウムイメージング

すべての動物処置は、標準的な動物倫理ガイドライン(欧州共同体指令86/609 / EU)に従って実施され、地元の動物倫理委員会によって承認されました。8週齢のLong Evansラットを本研究に使用しました。動物は市販の供給源から入手した( 資料表参照)。 1. 培地とフラットマウントアセンブリの準備 エイムズ培地(1L)1 Lのガラスボトルに、エイムズのミディアムパウダー、1.9 g / L NaHCO3、10 mlのペニシリン/ストレプトマイシン100x、および1 Lの脱イオン水を混ぜ合わせます( 材料表を参照)。pH を 7.4 に、浸透圧を 280 mOsm に、脱イオン水または NaHCO3 で調整します。フードの下の孔径0.2μmのフィルターで溶液をろ過して滅菌します。注:滅菌した培地は4°Cで保管してください。 この溶液は安定しており、最大1か月間使用できます。 メンブレンの取り付け1つのPTFE多孔質メンブレン( 材料表を参照)を、接着剤の小滴を使用してワッシャーに取り付けます。少なくとも15分間乾かします。 半透明にするには、メンブレンを70%エタノールに1分間浸します。 メンブレンを脱イオン水で2回すすぎ、エタノールを完全に除去します。不透明を防ぐために脱イオン水に保管してください。 2. GCLラベリングとラット網膜フラットマウント 注:この標識法では、RGCを置換されたアマクリン細胞から区別するものではありません。RGCの選択的標識が望まれる場合は、RGC特異的プロモーター11および/または視神経12を介した逆行性標識を有するAAVの使用を検討する。オンセンターとオフセンターのRGCのクラスを区別するために、光応答に基づいてRGCを分類し13,14、感度の向上と単一活動電位を測定する能力を提供する遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターの新しいバージョンを利用します15。 硝子体内注射8週齢のLong Evansラットに2%イソフルラン/1%O2 を足の反射がなくなるまで麻酔し、ラット鼻マスクで麻酔を維持します( 材料表を参照)。注意: 麻酔中は、体温を維持するために動物を温熱パッドの上に置きます。 市販の点眼薬を1滴投与して、瞳孔を拡張します。 手術を進める前に、眼底鏡検査とin vivo 網膜イメージングシステムを備えた光干渉断層撮影法(OCT)を使用して眼の異常を調べます。角膜と目的の接触を容易にするために、メトセル2%を1滴塗布します( 材料表を参照)。.注意: 異常が検出された場合は、その目以降の手順に進まないでください。 局所麻酔薬としてプレスケーンを1滴塗布します。.まぶたと輪縁結膜を市販の縫合糸フィラメントで固定します( 材料表を参照)。30Gの針を使用して、辺縁部から4mmの1mmの硬化切開術を作成します。36Gの鈍い針を精密シリンジに取り付け、遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターを運ぶAAV粒子を45°の角度で30秒間硝子体に注入します。本研究では、AAV2-CAG-GCaMP5G(HBSS中7.5×1011GC /mL)を用いた( 材料表参照)。注:潜在的に腫瘍原性の遺伝子産物または毒素分子をコードせず、ヘルパーウイルスなしで産生されるAAVコンストラクトは、バイオセーフティレベル1(BSL-1)施設で取り扱うことができます。それ以外の場合、BSL-2封じ込めの下でバイオハザード物質と見なされる場合は、適切な予防措置を講じる必要があります16。GCaMP をコードする AAV は BSL-1 と見なされ、バイオセーフティキャビネット下での操作は必要ありません。 炎症を予防し、抗生物質の予防としてTobradexを1滴塗布します( 材料表を参照)。 必要に応じて、もう一方の目で手順2、3、4を繰り返します。注:手術後12〜24時間で動物をチェックして、副作用がないことを確認してください。 注射の3日後、眼底鏡検査とin vivo 網膜イメージングシステムによるOCTを使用して網膜構造を調べます( 資料表を参照)。 注入の2週間後、GCLは蛍光を発するはずです。 in vivo 網膜イメージング システムを使用した蛍光眼底検査により、網膜構造と AAV 発現を評価します。注:Weitz et al.12によると、AAV2-CAG-GCaMP5Gからの蛍光は、注射後1週間で顕著になり、2週間で強まります。4週目以降、GCaMPの過剰発現は細胞罹患率を誘発します。死にかけた細胞は、刺激に反応して変動しない核および細胞質において高いベースライン蛍光シグナルを示します。健康な細胞では、GCaMPの発現は細胞質に限定され、核から除外されます7,8,12,17,18。これらの特徴は、顕微鏡イメージング中に生体外で観察できます。遺伝子発現のウィンドウは、ウイルスベクターと選択したプロモーターによって異なります。 網膜切除とフラットマウント注:注射後2〜3週間、硝子体内注射されたラットは、電気生理学プロトコルが始まる直前に、標準的な倫理ガイドライン(欧州共同体指令86/609 / EU)に従って安楽死させ、地域の倫理委員会によって承認されます。二酸化炭素(CO2)の吸入は、このプロトコルの安楽死の方法として使用されます。眼球摘出術湾曲した鉗子のペアを使用して眼窩の外側をそっと押し、眼窩から目をわずかに突き出します。 スプリングハサミを使用して、眼球に穴を開けないように注意しながら、目を保持している筋肉を切断して摘出します。注:このステップから始めて、酸素化(95%O2 / 5%CO2)エイムズ培地の実体顕微鏡下で網膜を解剖します。 網膜切除小さな湾曲した鉗子と細かいスプリングハサミを使用して、眼球から周囲の組織をすべて取り除きます。 約3cm×3cmのろ紙を用意し、3.5cmの皿の蓋の上に置きます。紙にエイムズメディウムを浸します。 眼球を紙の上に置き、前部をオペレーターに向けます。一対のまっすぐな鉗子を使用して眼球を保持し、皿の表面から約45°の角度でオラセラータの上に配置します。まっすぐな鉗子の間のスペースを基準として、ブレードで小さな切り込みを入れます。 眼球をエイムズの媒体に払い戻す。まっすぐな鉗子と細かいスプリングハサミを使用して、目の前部と後部を分離します。 2対のまっすぐな鉗子を使用してレンズを慎重に取り外します。次に、網膜を強膜から分離します。 網膜がアイカップから分離されるまで、細いスプリングハサミを使用して視神経に向かって強膜を切断します。 蛍光実体顕微鏡を使用して、カルシウム指示薬の発現が最も良い網膜の領域を特定します。注:ウイルスの拡散の程度は、硝子体内注射の成功によって異なります。網膜の大部分で蛍光を発するには、練習が必要な場合があります。治験責任医師の経験は、最適な結果を得る上で重要な役割を果たします。 カットチップのプラスチックピペットを使用して、網膜の選択した部分をマウントメンブレンに移します(マウントメンブレンのステップ)。一対のまっすぐな鉗子を使用して、GCLを上に向けて網膜を平らに取り付けます。 100 μLのピペットチップにプラスチック製のピペットを取り付けた状態で、培地を取り除き、網膜片が多孔質膜に接着するようにします。アセンブリをMEAにひっくり返して、GCLが電極の上に載るようにします。 サンプルバスに酸素添加エームス培地を充填します。 3. 電気刺激による Ex vivo カルシウムイメージング 注:この研究では、ex vivo 実験に概念実証MEAを使用しました。カスタムMEAは、Ti/Auトレースを有する厚さ500μmのホウケイ酸ガラス上に直径25μmの多孔質グラフェンベースの電極で作製され、その後、窒化ケイ素とSU-8フォトレジスト12で絶縁されました。但し、カルシウムイメージング法は、刺激に用いる電極材料によらず有効である。 酸素を添加したエイムズ培地が、33°Cのサンプル槽を5 mL/分の一定流量で常に灌流するように、灌流システムを設定します。 蛍光灯、FITCフィルターキューブ、CMOSカメラを備えた倒立蛍光顕微鏡を用いて、刺激電極やGCaMP発現細胞の蛍光が見える領域を網膜で検査します。この研究では、20x NA 0.75 対物レンズを使用しました。注:電極で細胞を効果的に刺激(および記録)するには、網膜と電極が密接に接触している必要があります。したがって、細胞は目に見えて電極と同じ焦点面にあります。そうでない場合は、手順8以降の網膜切除の手順を繰り返します。健常動物モデル(光受容体が機能している)の網膜を使用する場合、網膜はGCaMPセンサーの励起に使用される波長に感受性であるため、蛍光灯が点灯するたびに、光によって誘発反応が発生することに注意してください。これらの光によるカルシウムの変化は、組織の健康状態を評価するために使用できます。電気誘発反応と光が混ざらないようにするには、画像取得を開始する少なくとも1分前に蛍光灯をオンにしてください。 GCLで電気誘発応答を引き出すには、電流制御パルスを送信する電極を選択します。パルス発生器のソフトウェアで、適用するパルスの形状、振幅、持続時間、位相遅延、周波数などの電気刺激パラメータを設定します。注:有効な刺激パラメータは、50μsから100msのパルス幅まで大きく変化し、振幅は0.1μAから10μAの範囲です。これらのパラメータは、刺激周波数、刺激極性、パルス数、および期間遅延とともに、カルシウムイメージングによって観察される時空間応答に影響を与える可能性があります19,20,21,22。1 ms、2 μA の刺激を提供する 40 の二相性パルスの列は、多くの場合、標識されたニューロンに目に見える応答を生成します。 画像取得と刺激送達を同期させるには、パルス発生器を外部トリガとして使用して、画像取得の開始を制御します。出力トリガー信号を使用してカメラ( 資料表を参照)をパルス発生器に接続し、カメラソフトウェアの「キャプチャモード」を「外部開始トリガー」に設定します。カメラソフトウェアで[スタート]を押して、外部トリガーが起動するのを待ちます。パルス発生器ソフトウェアで画像取得を開始します。注意: 外部トリガーコントロールは、カメラによって設定が異なる場合があります。この研究では、通常、画像(512 x 512ピクセル、16ビットグレースケール)を10フレーム/秒で1分間取得し、10秒ごとに二相性パルス列のバーストを提供しました。パルスの送達は10秒後に始まるため、すべての実験の最初のフレームは自発的な活動に対応します。GCaMPセンサーと実行する分析によっては、カルシウムインジケーター8の立ち上がり時間と減衰時間に応じて記録速度を調整する必要がある場合があります。カルシウム指示薬15の単一活動電位を検出する感度を考慮する。 [電極数]_[パルス振幅]_[パルス幅]_[パルス周波数]_Image001のように、適用した電気刺激パラメータを含むファイル名で画像を保存します。 4. データ分析 ImageJ/FIJIは、細胞体細胞から経時的な蛍光強度プロファイルと空間座標を抽出します。「領域選択ツール」で関心領域(ROI)をセグメント化し、ROIマネージャーに追加します(分析>ツール>ROIマネージャー>追加)。ROI マネージャー メニューから、.zip フォルダーとして保存します (その他>保存)。注:通常、同じROIは同じFOVに対応しているため、すべての刺激実験に同じROIを適用できます。 抽出するパラメータとして「平均グレー値」を選択します(分析>測定値の設定)。 セル soma から “Mean gray value” を抽出するには、[ More > Multi Measure] をクリックします。ダイアログボックスが表示されます。[ 600 個のスライスをすべて測定] オプションと [スライスごとに 1 行 ] オプションを有効にして、列が ROI に対応し、行が時間枠に対応する 1 つのテーブルを取得します。生成されたテーブルを.xlsスプレッドシートとして保存します。 抽出するパラメータとして「重心」を選択します(Analyze>Set measurements)。 [ 測定] をクリックして、ROI から “重心” を抽出します。生成されたテーブルは、ROI の座標 (X,Y) に対応します。.xlsスプレッドシートとして保存します。 刺激に応答する細胞を識別するためのカスタムビルドスクリプト注:ここではMATLAB( 材料表を参照)を使用しましたが、説明されている手順は任意のプログラミング言語で実現できます。ユーザーは、対応する作成者に依頼することで、カスタムビルドのスクリプトを入手できます。光退色効果の補正:背景と光退色効果を軽減するために、各バースト前の非刺激期間から15〜20フレームを取得し、線形曲線[フィット(ポリ1)]にフィットさせます。注:この場合、パルス列の周期的なバーストが10秒ごとに送信される合計600フレームのムービーでは、フレーム1:90、170:190、270:290、370:390、470:490、570:590は非刺激期間と見なされます。 (X-min) / (max-min) の式を使用して正規化します。 応答細胞の同定正規化されたデータから非刺激期間の二乗平均平方根 (RMS) を計算します。これはベースライン信号と見なされます。 刺激期間の最大値(非刺激期間間のフレーム)を計算します。この場合、パルス列を周期的に10秒ずつ送る合計600フレームの動画では、91:169、191:269、291:369、391:469、491:569を刺激期間とみなした。 特定のROIについて、最大値がベースライン信号を2.5倍上回る場合は、その刺激期間に応答するようにセルにタグを付けます。細胞が5つの刺激期間のうち3つに反応する場合は、応答細胞として分類します。