تصوير الكالسيوم في شبكية العين المسطحة المحفزة كهربائيا
Summary
الأطراف الاصطناعية للشبكية لديها القدرة على توليد تصورات بصرية. للمضي قدما في تطوير أطراف اصطناعية جديدة ، هناك حاجة إلى طرق خارج الجسم الحي لاختبار الأجهزة قبل الزرع. تقدم هذه المقالة بروتوكولا شاملا لدراسة نشاط الكالسيوم في طبقة خلايا العقدة الشبكية عند تعرضها للتحفيز الكهربائي.
Abstract
ضمور الشبكية هو السبب الرئيسي للعمى في جميع أنحاء العالم. تبذل جهود مكثفة لتطوير أطراف اصطناعية متقدمة للشبكية يمكنها تجاوز خلايا مستقبلات الضوء الضعيفة في شبكية العين المتدهورة ، بهدف استعادة الرؤية جزئيا عن طريق تحفيز الإدراك البصري. تتضمن إحدى الطرق الشائعة للتحقيق تصميم وإنتاج أجهزة قابلة للزرع ذات بنية مادية مرنة ، تحتوي على عدد كبير من الأقطاب الكهربائية. وهذا يتيح توليد الإدراك البصري بكفاءة ودقة. ومع ذلك ، مع كل تقدم تكنولوجي ، تنشأ حاجة إلى طريقة خارج الجسم الحي موثوقة ويمكن التحكم فيها للتحقق من وظائف الجهاز قبل التقدم إلى التجارب في الجسم الحي ، حيث تلعب عوامل تتجاوز أداء الجهاز. تقدم هذه المقالة بروتوكولا شاملا لدراسة نشاط الكالسيوم في طبقة خلايا العقدة الشبكية (GCL) بعد التحفيز الكهربائي. على وجه التحديد ، يتم تحديد الخطوات التالية: (1) وضع علامات فلورية على شبكية العين باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا ، (2) التقاط إشارة التألق باستخدام مجهر مضان مقلوب أثناء تطبيق أنماط مميزة من التحفيز الكهربائي ، و (3) استخراج وتحليل آثار الكالسيوم من الخلايا الفردية داخل GCL. باتباع هذا الإجراء ، يمكن للباحثين اختبار بروتوكولات التحفيز الجديدة بكفاءة قبل إجراء التجارب في الجسم الحي .
Introduction
تحتوي شبكية العين على مستقبلات ضوئية ، وهي خلايا مسؤولة عن استشعار الضوء. يلتقطون الفوتونات ويحولونها إلى نبضات عصبية. ثم تتم معالجة هذه النبضات داخل شبكية العين وتنتقل إلى القشرة البصرية ، مما يؤدي إلى تكوين صورة مرئية1. التهاب الشبكية الصباغي (RP) والتنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) من الأمراض التنكسية التي تتميز بالفقدان التدريجي للمستقبلات الضوئية. تعد اعتلالات الشبكية هذه من بين الأسباب الرئيسية للعمى في جميع أنحاء العالم1 ، حيث تؤثر على ملايين الأفراد ولها عواقب طبية وشخصية واجتماعية واقتصادية كبيرة على المرضى وأنظمة الرعاية الصحية والمجتمع ككل. علاوة على ذلك ، مع شيخوخة السكان ، من المتوقع أن تزداد حالات AMD بنسبة 15٪ بحلول عام 20502.
حاليا ، هناك العديد من الجهود البحثية الجارية لاستعادة الرؤية لدى المرضى المتضررين من هذه الحالات3. أحد الأساليب الواعدة هو استخدام الأطراف الاصطناعية للشبكية ، والتي أثبتت فعاليتها في استعادة الرؤية جزئيا 4,5. تلتقط هذه الأجهزة الضوء من المشهد المرئي وتحوله إلى نبضات كهربائية. يتم تسليم هذه النبضات من خلال أقطاب كهربائية داخل مجموعة أقطاب كهربائية دقيقة (MEA) مزروعة في العين ، مما يحفز الخلايا العصبية الباقية ويتجاوز وظيفة المستقبلات الضوئية المفقودة. تنقل خلايا العقدة الشبكية المنشطة (RGCs) الإخراج إلى الدماغ ، حيث يتم تفسيره على أنه إدراك بصري. ومع ذلك ، فإن القيود الرئيسية للزرع الحالي تكمن في دقة واجهة القطب والأنسجة6 والتحفيز غير الانتقائي لأنواع الخلايا المختلفة. لذلك ، لتحسين تصميم الأجهزة الجديدة القابلة للزرع لاستعادة الرؤية بشكل أكثر كفاءة ، من الأهمية بمكان فهم كيفية تطوير نماذج التحفيز لتنشيط الخلايا بشكل انتقائي على مقربة من الأقطاب الكهربائية.
تصوير الكالسيوم هو تقنية مستخدمة على نطاق واسع لدراسة النشاط العصبي ، وتقدم العديد من المزايا على الطرق غير البصرية 7,8. أولا ، يوفر دقة خلوية ودون خلوية. ثانيا ، يمكن أن تستهدف علامات الكالسيوم أنواعا معينة من الخلايا. ثالثا ، يسمح بالتتبع على المدى الطويل ، ورابعا ، يتيح مراقبة مجموعات الخلايا بأكملها مع التمييز بين الخلايا النشطة وغير النشطة. توفر هذه الطريقة دليلا غير مباشر على النشاط الخلوي بدقة زمنية في حدود مئات المللي ثانية. تخضع مؤشرات الكالسيوم الفلورية المشفرة وراثيا ، مثل مستشعرات GCaMP ، لتغيير مطابق عند الارتباط بالكالسيوم ، مما يؤدي إلى زيادة التألق9. النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي المؤتلف (AAVs) هي وسيلة فعالة لتحويل خلايا الشبكية باستخدام GCaMP10.
يقدم هذا البروتوكول طريقة فعالة تستخدم تصوير الكالسيوم لاختبار بروتوكولات تحفيز غرسات الشبكية. على وجه التحديد ، نركز على أنسجة شبكية الفئران خارج الجسم الحي ونقدم تعليمات مفصلة خطوة بخطوة ، من الحصول على العينات إلى تحليل البيانات. من خلال تقديم هذا الدليل الشامل ، يمكن للباحثين من خلفيات مختلفة الشروع في تجربة التحفيز الكهربائي بثقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعمل البروتوكول الموصوف هنا على دراسة ديناميكيات الكالسيوم التي تحدث في GCL لشبكية الفئران عند التحفيز الكهربائي المقدم مع MEA. إنها طريقة موثوقة ويمكن التحكم فيها ولكنها تتطلب بعض التدريب ، لا سيما لتسمية GCL بشكل موحد بكفاءة وتركيب شبكية العين بشكل صحيح لضمان الاتصال الأمثل بين الأنسجة والقطب الكهربائي. هذا البروتوكول خاص بالقوارض ويحتاج إلى تكييف إذا تم تطبيقه على أنواع مختبرية مختلفة. يتم عرض النقاط الحرجة والتعديلات والقيود على المنهجية بالتفصيل.
الحقن داخل الجسم الزجاجي
تستخدم الحقن على نطاق واسع لتوصيل الجينات العينية ، مع كون الحقن داخل الجسم الزجاجي هو الإجراء المفضل. لقد ثبت أنها أكثر أمانا وأقل توغلا مقارنة بالحقن تحت الشبكية ، والتي تقدم الجزيئات ذات الأهمية مباشرة بين المستقبلات الضوئية وظهارة الشبكية الصبغية (RPE) ، مما يهدد بانفصال الشبكية10. ومع ذلك ، هناك قيود ، خاصة عند إجراء هذه الحقن في نماذج القوارض. الفكاهة الزجاجية هلامية ، تعيق الانتشار الفيروسي. علاوة على ذلك ، فإن العدسة في عيون القوارض كبيرة ، مما يجعلها غير تافهة لإدخال الإبرة دون خدشها. إبر الحقن الدقيقة حساسة وتحتاج إلى استبدالها كثيرا. لمنع الانسداد ، اغسلها بالماء منزوع الأيونات قبل وبعد كل استخدام واستبدلها بانتظام. بالإضافة إلى ذلك ، قم بحقن المحتوى ببطء لمنع ارتجاع المحلول والتغيرات في ضغط العين. قد يتطلب تحقيق مضان كبير وموحد عبر شبكية العين ممارسة.
نقل خلايا الشبكية
النواقل الفيروسية هي طريقة ممتازة لتوصيل الجينات في الجسم الحي ، وقد استخدمت AAVs على نطاق واسع لتحويل خلايا الشبكية10. تمت الموافقة عليها كعلاج لبعض اعتلالات الشبكية التي تسبب العمى البشري24. ومع ذلك ، فإن سعة الناقل الخاصة بهم تقتصر على 5 كيلو بايت ، بما في ذلك العناصر التنظيمية المطلوبة (على سبيل المثال ، المروج)10,25. هناك العديد من الأنماط المصلية المتاحة ، ولكل منها انتحاء مختلف. اختر أنسب AAV بناء على الجينات المراد تسليمها والخلايا المراد تحويلها26. لوضع علامات على RGCs ، يوصى باستخدام AAV227.
نافذة التعبير الجيني
التعبير الفيروسي الأمثل ل AAV2-CAG-GCaMP5G هو من 2 إلى 3 أسابيع بعد الحقن12,18. بعد هذا الإطار الزمني ، تصبح النوى من الخلايا المنقولة فلورية ، وتتوقف الخلايا عن الاستجابة للمنبهات ، وتموت في النهاية7،28،29. ويرجع ذلك إلى الإفراط في التعبير عن مؤشر GCaMP ، والذي يتم نقله إلى النواة. ستختلف النافذة الزمنية للتعبير الجيني الأمثل اعتمادا على الناقل الفيروسي والمروج المختار30 ويجب تحديدها تجريبيا قبل متابعة هذا البروتوكول.
الاتصال الأنسجة القطب
للحصول على أفضل النتائج والقابلة للتكرار ، يعد تحقيق اتصال جيد بين الأنسجة والقطب أمرا بالغ الأهمية. عادة ما يكون ضعف الاتصال بسبب الانحناء الطبيعي لشبكية العين. تتمثل إحدى الطرق في تقطيع شبكية العين إلى أرباع ، وتركيب وتصوير قسم واحد في كل مرة. يمكن تسطيح أجزاء صغيرة من شبكية العين بشكل أفضل ، مما يؤدي إلى اتصال أكثر فعالية مع سطح MEA. سبب آخر محتمل لضعف الاتصال هو وجود الفكاهة الزجاجية. عند إجراء تجارب التحفيز التي تحاكي غرسة فوق الشبكية ، من المهم إزالة الخلط الزجاجي بعناية أثناء استئصال الشبكية لأنه يمكن أن يعمل كعازل للتيار. هنا ، يتم وصف طريقة بسيطة للتحقق مما إذا كان الاتصال كافيا من خلال تصور القطب والخلايا في نفس المستوى البؤري.
بديل لقياسات الشبكية خارج الجسم الحي هو زراعة الخلايا العصبية مباشرة على سطح الأقطاب الكهربائية. يمكن أن تكون الثقافة الأولية للخلايا العصبية ، مثل الخلايا العصبية الحصينية31 ، مفيدة للاختبارات الأولية لتقييم وظائف جهاز التحفيز الجديد. ومع ذلك ، لا يزال هذا النهج يتطلب استخدام المختبر ولا يمثل تعقيد شبكة الشبكية ، وهو أمر مهم لتقييم الاستجابات المشبكية للتحفيز.
لتصور الخلايا الموجودة أسفل آثار القطب الكهربائي والأقطاب الكهربائية ، يمكن استخدام MEAs المصنعة بمواد شفافة مثل أكسيد القصدير الإنديوم (ITO)19،20،32. بالإضافة إلى القياسات البصرية، يمكن تقييم نشاط GCL عند التحفيز الكهربائي من خلال التسجيلات الكهربائية. يمكن استخدام MEA لتسجيل إمكانات المجال المحلي (LFP) للأنسجة. ومع ذلك ، فإن هذا يضر بالدقة المكانية ، حيث يلتقط كل قطب كهربائي النشاط من خلايا متعددة في وقت واحد (اعتمادا على أبعاد القطب). يتغلب التسجيل البصري على هذا القيد ويوفر تخطيطا أعلى دقة مكانية. ميزته الرئيسية هي القدرة على التمييز بين الخلايا النشطة وغير النشطة أثناء قياس مجال الرؤية الكبير بدقة خلية واحدة. من بين جميع مراسلي النشاط الخلوي ، يتم وصف مؤشرات الكالسيوم بشكل جيد والأكثر استخداما33.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون لميرشي ريفاس ، وأنجيل ساندوفال ، وخيسوس بلاناغوما ، وجوردي كورتيس ، وساندرا أورتونوبيس لارا ، وألينا هيرشمان (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) على دعمهم الفني ، إلى آنا دواري (VHIR ، معهد فال ديبرون للأبحاث) من مجموعة أبحاث طب العيون لدعمهم في الحقن داخل الجسم الزجاجي وتصوير الشبكية في الجسم الحي .
والكيانات الممولة التي دعمت هذا العمل هي: مؤسسة سيلكس؛ ومؤسسة سيلكس. مؤسسة مير بويغ; وزارة الاقتصاد والمنافسة – برنامج سيفيرو أوتشوا لمراكز الامتياز في مجال البحث والتطوير (CEX2019-000910-S, [MCIN/AEI/10.13039/501100011033])؛ Generalitat de Catalunya من خلال برنامج CERCA ؛ Laserlab-Europe (EU-H2020 GA رقم 871124) ؛ مؤسسة لا كايشا (LCF/HR19/52160003)؛ وفوندو سوشال يوروبيو (PRE2020-095721 ، M.C.).
Materials
| 20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | – |
| 3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | – |
| 30 G needle | VWR | 613-5373 | – |
| 36 G blunt needle | World Precision Instruments | NF36BL-2 | – |
| 6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | – |
| AAV2-CAG-GCaMP5G | Vector Biolabs | – | – |
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420 | – |
| Blade | Swann-morton | 0308 | – |
| Camera | Hamamatsu | ORCA Flash v4.0 | – |
| Carbogen | Air liquide | – | – |
| Curved-forceps | – | – | – |
| Fine spring-scissors | FST | 91501-09 | – |
| FITC filter cube | Nikon | Standard series | – |
| Fluorescent lamp | Nikon | C-HGFI | – |
| Fluorescent stereomicroscope | Nikon | SMZ25 | – |
| HBSS | Capricorn | HBSS-1A | – |
| ImageJ/FIJI | NIH | v1.50i | – |
| In vivo retinal imaging system | Phoenix Research Laboratories | Micron III | – |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | – |
| Isofluorane | Arrane Baxter Laboratories | – | – |
| Long-Evans rat | Janvier | – | – |
| MATLAB (Version R2021b) | Mathworks | – | – |
| Media filters | Merckmillipore | SCGPS02RE | – |
| Methocel 2% | Omni Vision | – | – |
| Microelectrode array (MEA) | – | Custom-made | |
| NaHCO3 | Thermofisher | 42427 | – |
| Penicillin/Streptomycin 100x | Thermofisher | 15140122 | – |
| Phenylephrine | Alcon Cusí Laboratories | 653437.3 | 100 mg/mL |
| Plastic pipette | VWR | 612-1793 | – |
| Porous membrane | Merckmillipore | #JVWP01300 | – |
| Precision syringe | World Precision Instruments | 10 µl Nanofil | – |
| Prescaina | Llorens | – | Oxybuprocaine chlorhydrate (2 mg/mL), local anesthetic |
| Rat nasal mask | Xenotec | XRK-RA | – |
| Small curved-forceps | Bbraun | AESCBD311R | – |
| Spring-scissors | FST | 15040-11 | – |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | – |
| Straight forceps | FST | 11252-20 | – |
| Suture filament | Vitrex Medical | 4328 | Nilon monofilament, 7/0, DS12 |
| Tobradex | Alcon Cusí Laboratories | – | Tobramycin (3 mg/mL) and dexamethasone (1 mg/mL) |
| Tropicamide | Alcon Cusí Laboratories | 653486 | 10 mg/mL |
| Washer | Thorlabs | W8S038 | – |
References
- Bourne, R. R. A., et al. Prevalence and causes of vision loss in high-income countries and in Eastern and Central Europe in 2015: Magnitude, temporal trends and projections. British Journal of Ophthalmology. 102 (5), 575-585 (2018).
- Li, J. Q., et al. Prevalence and incidence of age-related macular degeneration in Europe: a systematic review and meta-analysis. British Journal of Ophthalmology. 104 (8), 1077-1084 (2020).
- Roska, B., Sahel, J. A. Restoring vision. Nature. 557 (7705), 359-367 (2018).
- Hornig, R., Velikay-Parel, M. Retina implants. Implantable Sensor Systems for Medical Applications. , 469-496 (2013).
- Lewis, P. M., et al. Advances in implantable bionic devices for blindness: a review. ANZ Journal of Surgery. 86 (9), 654-659 (2016).
- Weiland, J. D., Walston, S. T., Humayun, M. S. Electrical stimulation of the retina to produce artificial vision. Annual Review of Vision Science. 2, 273-294 (2016).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6, 875-881 (2009).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, 137-141 (2001).
- Sahu, B., Chug, I., Khanna, H. The ocular gene delivery landscape. Biomolecules. 11 (8), 1135 (2021).
- Hanlon, K. S., et al. A novel retinal ganglion cell promoter for utility in AAV vectors. Frontiers in Neuroscience. 11, (2017).
- Weitz, A. C., et al. Imaging the response of the retina to electrical stimulation with genetically encoded calcium indicators. Journal of Neurophysiology. 9 (7), 1979-1988 (2013).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
- Baden, T., Berens, P., Franke, K., Román Rosón, M., Euler, T. The functional diversity of retinal ganglion cells in the mouse. Nature. 529, 345-350 (2016).
- Zhang, Y., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. Nature. 615, 884-891 (2023).
- Meyer, E. L., Jenkins, C., Rengarajan, K. NIH Guidelines April 2019. Applied Biosafety. 24, (2019).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chang, Y. -. C., Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. GCaMP expression in retinal ganglion cells characterized using a low-cost fundus imaging system. Journal of Neural Engineering. 14 (5), 056018 (2017).
- Weitz, A. C., et al. Improving the spatial resolution of epiretinal implants by increasing stimulus pulse duration. Science Translational Medicine. 7 (318), 1-12 (2015).
- Chang, Y. C., Ghaffari, D. H., Chow, R. H., Weiland, J. D. Stimulation strategies for selective activation of retinal ganglion cell soma and threshold reduction. Journal of Neural Engineering. 16 (2), 026017 (2019).
- Im, M., Fried, S. I. Temporal properties of network-mediated responses to repetitive stimuli are dependent upon retinal ganglion cell type. Journal of Neural Engineering. 13 (2), 025002 (2016).
- Jensen, R. J., Ziv, O. R., Rizzo, J. F. Thresholds for activation of rabbit retinal ganglion cells with relatively large, extracellular microelectrodes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (4), 1486-1496 (2005).
- Ramos, M. S., et al. Patient-reported complications after intravitreal injection and their predictive factors. Ophthalmology Retina. 5 (7), 625-632 (2021).
- Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapy. Gene Therapy. 19 (2), 162-168 (2012).
- Zin, E. A., Ozturk, B. E., Dalkara, D., Byrne, L. C. Developing new vectors for retinal gene therapy. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. , a041291 (2023).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 17, 69-82 (2020).
- Hellström, M., et al. Cellular tropism and transduction properties of seven adeno-associated viral vector serotypes in adult retina after intravitreal injection. Gene Therapy. 16 (4), 521-532 (2009).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11, 566-597 (2016).
- Yang, Y., et al. Improved calcium sensor GCaMP-X overcomes the calcium channel perturbations induced by the calmodulin in GCaMP. Nature Communications. 9, 1504 (2018).
- Nieuwenhuis, B., et al. Improving adeno-associated viral (AAV) vector-mediated transgene expression in retinal ganglion cells: comparison of five promoters. Gene Therapy. 30, 503-519 (2023).
- Cunquero, M., Aguilar, E., Loza-Alvarez, P., Planagumà, J. Hippocampal neuronal cultures to detect and study new pathogenic antibodies involved in autoimmune encephalitis. Journal of Visualized Experiments. 184, e63829 (2022).
- Behrend, M. R., Ahuja, A. K., Humayun, M. S., Chow, R. H., Weiland, J. D. Resolution of the epiretinal prosthesis is not limited by electrode size. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 19 (4), 436-442 (2011).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
