Burada, elektron mikroskobu ızgaralarına tek bir tek katmanlı grafen uygulamak için bir protokol ve bunların kriyoEM yapı belirlemede kullanılmak üzere nasıl hazırlanacağını açıklıyoruz.
Kriyojenik elektron mikroskobu (cryoEM), makromoleküler komplekslerin atomik yapısını araştırmak için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. CryoEM için numune hazırlama, numunelerin tipik olarak fenestre edilmiş bir destek filminin delikleri içinde asılı duran ince bir camsı buz tabakasında korunmasını gerektirir. Bununla birlikte, kriyoEM çalışmaları için yaygın olarak kullanılan tüm numune hazırlama yaklaşımları, numuneyi hava-su arayüzüne maruz bırakarak, numune üzerinde genellikle denatürasyon, agregasyon ve karmaşık ayrışma ile sonuçlanan güçlü bir hidrofobik etki yaratır. Ayrıca, numunenin bölgeleri ile hava-su arayüzü arasında tercih edilen hidrofobik etkileşimler, makromoleküller tarafından benimsenen yönelimleri etkileyerek anizotropik yönlü çözünürlüğe sahip 3D rekonstrüksiyonlarla sonuçlanır.
CryoEM numunelerinin tek bir grafen tabakasına adsorpsiyonunun, arka plan gürültüsünün girişini en aza indirirken hava-su arayüzü ile etkileşimleri azaltmaya yardımcı olduğu gösterilmiştir. Grafen destekleri, cryoEM görüntüleme için gerekli protein konsantrasyonunu önemli ölçüde düşürme avantajını da sunar. Bu desteklerin avantajlarına rağmen, grafen kaplı ızgaralar, ticari seçeneklerin engelleyici maliyeti ve büyük ölçekli şirket içi üretimle ilgili zorluklar nedeniyle kriyoEM topluluğu tarafından yaygın olarak kullanılmamaktadır. Bu makale, neredeyse tam tek katmanlı grafen kaplamasına sahip kriyoEM ızgara gruplarını hazırlamak için etkili bir yöntemi açıklamaktadır.
Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskobu (cryoEM), biyomakromoleküllerin 3D yapılarını araştırmak için kullanılan, giderek daha uygulanabilir hale gelen bir teknolojidir. Son on yılda elektron mikroskobu optiği, doğrudan elektron algılama1 ve bilgisayar algoritmaları2,3,4’teki teknolojik gelişmeler, cryoEM kullanıcılarının biyokimyasal olarak kararlı makromoleküler komplekslerin yapılarını atomik çözünürlüğe yakın 5,6,7,8’e kadar belirlemelerini sağlamıştır . Bu ilerlemelere rağmen, biyolojik örneklerin çoğunun bu kadar yüksek çözünürlüklerde çözülmesini engelleyen kriyoEM görüntüleme için numunelerin korunmasında dikkate değer engeller bulunmaktadır.
Yüksek çözünürlüklü kriyoEM analizi için numune hazırlama, ince bir vitrifiye buz tabakası içinde çok çeşitli yönlerde eşit olarak dağılmış makromoleküllerin yakalanmasını içerir. “Leke ve daldırma” dondurma yöntemleri, kriyoEM çalışmalarıiçin ızgaralar üzerinde biyolojik numunelerin ince filmlerini oluşturmak için kullanılan en yaygın kullanılan yöntemlerdir 9,10. Bu yöntemler, hidrofilik hale getirilmiş fenestrat bir film içeren bir EM ızgarasına birkaç mikrolitre numune çözeltisinin uygulanmasını ve ardından ızgarayı hızla bir sıvı etan veya etan-propan karışımı kriyojenine daldırmadan önce numunenin çoğunluğunun filtre kağıdı ile lekelenmesiniiçerir 9.
Bu yöntem, çok çeşitli biyolojik örneklerin yapılarını belirlemek için başarıyla kullanılmış olsa da, yaygın olarak kullanılan tüm cryoEM örnek hazırlama yöntemleri, örnekleri hidrofobik hava-su arayüzüne (AWI) maruz bırakır ve bu da genellikle yüksek çözünürlüklü yapı belirlemeyi sınırlayan sorunları ortaya çıkarır. Biyolojik örneklerin AWI’ye maruz kaldıklarında denatüre olma eğiliminin yüksek olduğu tespit edilmiştir, bu da karmaşık toplama ve sökmeyeyol açabilir 11,12,13,14. Ayrıca, biyolojik örneklerin yüzeylerindeki hidrofobik yamalar, parçacıkların buzda tercih edilen yönelimleri benimsemesine neden olur12. Birçok senaryoda, numunenin tek bir hidrofobik bölgesi, tüm parçacıkları buzda tekil bir yönelim benimsemeye zorlar ve böylece güvenilir bir yeniden yapılandırma oluşturma yeteneğini ortadan kaldırır. AWI ile ilgili sorunlara ek olarak, numuneler, delikler15 içindeki buzda asılı kalan parçacıkların sayısını sınırlayarak, fenestre edilmiş film tabakasının yüzeyi için bir afinite gösterebilir.
AWI veya filmler ile etkileşimlerden kaynaklanan bu sorunları azaltmak için çeşitli metodolojik ve teknolojik çözümler geliştirilmiştir16,17. Popüler bir yaklaşım, EM ızgaralarının fenestre filmini ince (onlarca nanometre) amorf karbon tabakası ile kaplamaktır. Bu kaplama, numuneyi AWI15,18,19,20 ile etkileşimlerden kısmen koruma avantajıyla, partiküllerin adsorbe edilebileceği delikler boyunca kesintisiz bir yüzey sağlar. Bununla birlikte, ek karbon katmanı, görüntülenen bölgelerdeki arka plan sinyali miktarını artırarak, özellikle küçük (<150 kDa) numuneler için ulaşılabilir çözünürlüğü tehlikeye atabilecek gürültüye neden olur. Son yıllarda, cryoEM ızgaralarında destekleyici filmler üretmek için grafen oksit (GO) pullarının kullanılmasının geleneksel amorf karbona göre avantajları olduğu gösterilmiştir. GO pulları, grafit katmanlarının oksidasyonu yoluyla üretilir, bu da yüzeylerde ve kenarlarda karboksil, hidroksil ve epoksi grupları formundaki önemli oksijen içeriği nedeniyle hidrofilik olan sözde kristalli tek katmanlı grafit tabakaları ile sonuçlanır. Sulu süspansiyonlardaki ticari GO pulları ucuzdur ve GO pullarını EM ızgaralarına uygulamak için çok sayıda yayınlanmış yöntem vardır18,21. Bununla birlikte, bu yöntemler genellikle yalnızca kısmen GO pulları ile kaplanmış ızgaraların yanı sıra birden fazla GO pulu katmanı içeren bölgelerle sonuçlanır. Ayrıca, GO pulları, ince amorf karbon22,23 ile gözlemlenene yakın olan cryoEM görüntülerine gözle görülür bir arka plan sinyaline katkıda bulunur.
Tek bir 2D kristal karbon atomu dizisinden oluşan bozulmamış tek katmanlı grafen, elektron mikroskobunda faz kontrastı üretmediği için GO’dan farklıdır. Böylece tek katmanlı grafen, biyolojik numunelerin görüntülenmesi için görünmez bir destek tabakası oluşturmak için kullanılabilir. Tek katmanlı grafen ayrıca GO’dan daha güçlüdür ve bir EM ızgarası üzerinde tek bir tek katman olarak uygulanabilir ve grafen kaplı EM ızgaralarının imalatındaki son gelişmeler, şirket içinde yüksek kapsamlı tek katmanlı grafen ızgaraları hazırlamayı mümkün kılmıştır 24,25,26,27,28,29,30. Bununla birlikte, kriyoEM yapı tayini için grafen kaplı ızgaraların kullanılmasının faydalarına rağmen, ticari seçeneklerin engelleyici maliyeti ve şirket içi üretimin karmaşıklığı nedeniyle yaygın olarak kullanılmamaktadır. Burada, biyolojik örneklerin kriyoEM yapısının belirlenmesi için tek katmanlı bir grafen ile kaplanmış EM ızgaralarını etkili bir şekilde üretmek için adım adım bir kılavuz açıklıyoruz (Şekil 1). Bu ayrıntılı protokolü izleyerek, cryoEM araştırmacıları tek bir günde düzinelerce yüksek kaliteli grafen destek ızgarasını tekrarlanabilir bir şekilde hazırlayabilirler. Grafen kaplı ızgaraların kalitesi, bir LaB6 filamenti ile donatılmış düşük kaliteli bir transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanılarak kolayca incelenebilir.
Biyolojik numunelerin ince bir camsı buz tabakasında korunması, yüksek çözünürlüklü kriyoEM yapısının belirlenmesi için kritik öneme sahip bir adımdır. Bununla birlikte, araştırmacılar genellikle tercih edilen oryantasyon, karmaşık sökme, denatürasyon ve agregasyon getiren AWI ile etkileşimlerden kaynaklanan sorunlarla karşılaşırlar. Ayrıca, numuneler, fenestre edilmiş bir filmin delikleri boyunca asılı duran ince buzu doldurmak için her zaman yeterince konsantre edilemez. Birkaç araştırma grubu, bu sınırlamaların bazılarının üstesinden gelmeye yardımcı olmak için EM ızgaralarını tek katmanlı bir grafen ile kaplamak için yöntemler geliştirmiştir 24,25,26,27,28,29,30 ve grafen ızgaraları büyük bir başarı ile kullanılmıştır. Burada, şirket içinde grafen ızgara gruplarını etkili bir şekilde hazırlamak ve TEM tarafından grafen ızgaralarının kalitesini incelemek için adım adım talimatlar sunuyoruz. Aşağıda ana hatlarıyla belirttiğimiz bazı kritik adımlar sırasında özel dikkat gösterilmesi gerektiğini vurguluyoruz.
Grafen, havadaki kirleticileri çekme konusunda güçlü bir eğilime sahiptir. Bu nedenle, grafen ızgara üretim işlemi sırasında, grafen/Cu levha veya ızgaralarla temas eden tüm aletlerin temiz ve tozsuz olduğundan emin olmak önemlidir. Grafeni aktarmak için kullanılan cam lameller, etanol ve DI su ile durulanarak veya bir hava silgi kullanılarak temizlenebilir. Ayrıca çeker ocak altında çalışılması ve grafen levhaların ve ızgaraların her zaman folyo veya temiz bir cam plaka ile kaplı tutulması tavsiye edilir. Izgaralardaki toz veya kirleticiler, grafenin EM ızgaralarına tamamen yapışmasını engelleyebilir. Grafen veya grafen kaplı ızgaraları tutarken, grafen filmin statik boşalmadan zarar görmesini önlemek için elektriksel olarak topraklanması önemlidir. Statik boşalma, bir bilek topraklama kayışı kullanılarak, grafen veya grafen ızgaraları her tutulduğunda topraklanmış metal bir nesneye dokunarak ve/veya cımbızı tutan ele eldiven takmayarakönlenebilir 24.
Tek bir grafen tabakası çok ince olduğundan (bir karbon atomunun genişliği), grafenin ızgaralara aktarılması sırasında grafenin MMA veya poli-MMA (PMMA) gibi organik bir tabaka ile desteklenmesi önemlidir. PMMA, grafen transferi için en yaygın kullanılan malzemedir. Bununla birlikte, PMMA’nın grafen ile güçlü bir afinitesi vardır ve genellikle grafen film üzerinde polimer kontaminasyonuna neden olabilir. MMA, daha az kalıntı kontaminasyon bıraktığı için bu protokolde kullanılır25. Bununla birlikte, hem PMMA hem de MMA, grafen filmin bazı bölgelerinde gözlemlenebilen kırışıklıklar ve çatlaklar oluşturma dezavantajına sahiptir (Şekil 3B). CVD yöntemi31 ile grafen büyümesi sırasında yaygın olarak meydana geldikleri için bu kırışıklıklardan kaçınmak zor olabilir. Son zamanlarda ultra düz grafenin kırışıklık olmadan büyütülmesi için bir yöntem geliştirilmiştir, bu sayede bakır folyo, bir büyüme substratı olarak bir Cu (111) / safir gofret ile değiştirilir32.
Deneyimlerimize dayanarak, bakır aşındırma işleminden sonra kırılgan hale gelen ve sonraki adımlarda işlenmesi zor olan üreticilerden polimer kaplı Cu-grafen levhalar satın almaktansa, grafen/Cu levhaları satın almak ve grafeni şirket içinde MMA ile desteklemek daha iyidir. MMA kaplama için kullandığımız spin kaplayıcı, daha önce açıklandığı gibi yerel bir bilgisayar/donanım mağazasından parçalar kullanılarak ucuza üretilebilir25.
MMA kaplama aşamasında, Cu-grafen levha üzerindeki grafen yüzeyinin tamamının MMA ile kaplanması önemlidir. Cu kazındıktan sonra, MMA-grafen yarı saydam hale gelecek ve MMA kapsamı olmayan alanlar boş delikler gibi görünecektir. Bakır tarafta MMA kaplamasını önlemek için, kaplama sırasında CVD filminden çıkan fazla MMA’yı emecek şekilde altına küçük bir parça kurutma kağıdı yerleştirmek önemlidir.
Aşındırma ve durulamadan sonra, MMA/grafen tabakası, su seviyesini kontrol etmek için bir şırınga veya peristaltik pompa ile ticari veya ev yapımı bir oluk sistemi kullanılarak EM ızgaralarına aktarılmaya hazırdır. Transfer adımından önce, ızgaraları ardışık kloroform, aseton ve IPA banyolarında iyice durulamak önemlidir. Grafen kaplı ızgaraların 65 °C’de pişirilmesi, grafen bütünlüğünün korunmasına yardımcı olur ve grafenin ızgaralara adsorpsiyonunu destekler. Son olarak, ızgaralarda MMA kontaminasyonunu önlemek için, MMA’yı bir aseton banyosunda iyice çıkarmak ve ızgaraları IPA’da temizlemek önemlidir. Yıkanmamış herhangi bir MMA kalıntısı EM ızgaralarında gözlemlenecek ve görüntülerin sinyal-gürültü oranını azaltacaktır (Şekil 3C). Grafen yüzeylerini daha fazla temizlemek için aseton-IPA yıkama işlemi tekrarlanabilir.
Grafen ızgaralarını hidrofilik hale getirmek için ızgaraları UV / Ozon’a maruz bıraktık. Farklı UV/ozon temizleyici modelleri, grafene zarar vermeden cryoEM numune hazırlama için grafen katmanını yeterince oksijenlendirmek için optimizasyon gerektirebilir. Sistemden bağımsız olarak, UV/Ozon tedavisinden hemen sonra kriyoEM numune uygulaması için bu ızgaraların kullanılması çok önemlidir. Grafen ızgaralarını hidrofilik hale getirmek için alternatif yöntemler diğer çalışmalardaaçıklanmıştır 33,34.
The authors have nothing to disclose.
Scripps Research’te bu yöntemleri oluştururken faydalı tartışmalar için Dr. Xiao Fan’a teşekkür ederiz. B.B., Hewitt Tıbbi Araştırma Vakfı’ndan doktora sonrası araştırma bursu ile desteklenmiştir. WC, Ulusal Bilim Vakfı doktora öncesi bursu tarafından desteklenmektedir. D.E.P, G.C.L.’ye NS095892 Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) HIBESI TARAFINDAN DESTEKLENMEKTEDIR. Bu proje aynı zamanda NIH hibeleri GM142196, GM143805 ve GCL’ye S10OD032467 tarafından da desteklenmiştir.
70% EtOH | Pharmco (190 pf EtOH) | 241000190CSGL | |
Acetone | Sigma Aldrich | 650501-4L | |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | 215589-500g | Hazardous; use extreme caution |
Chloroform | Sigma Aldrich | C2432-1L | |
Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids | PELCO | 16830-45 | |
Computer fan | Amazon (Noctua) | B07CG2PGY6 | |
Cover slip | Bellco Glass | 1203J71 | Standard cover slips |
Crystallizing dish | Pyrex | 3140-100 | |
Electronics duster | Falcon Safety Products | 75-37-6 | |
Falcon Dust-off Air Duster | Staples | N/A | |
Filter papers | Whatman | 1001-055 | |
Fine tip tweezer | Dumont | 0508-L4-PO | |
Flask | Pyrex | 4980-500 | |
Fork | Supermarket | N/A | |
Glass pasteur pipette | VWR | 14672-608 | |
Graphene/Cu | Graphenea | N/A | CVD monolayer graphene cu |
Grid Coating Trough | Ladd Research Industries | 10840 | Fragile |
Isopropanol | Fisher Scientific | 67-63-0 | |
Kapton Tape | Amazon (MYJOR) | MY-RZY001 | Polyimide tape |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
Long twzeer | Cole Parmer Essentials | UX-07387-15 | |
Metal grid holder | Ted Pella | 16820-81 | |
MMA(8.5)MMA EL 6 | KAYAKU Advanced Materials | M31006 0500L 1GL | Flammable |
Model 10 Lab Oven | Quincy Lab, Inc. | FO19013 | |
Petri dish | Pyrex | 3610-102 | |
Plasma cleaner (Solarus 950) | Gatan, Inc. | N/A | |
Scissors | Fiskars | 194813-1010 | |
Standard Analog Orbital Shaker | VWR | 89032-088 | |
UltrAuFoil R1.2/1.3 – Au300 | Quantifoil | N/A | Holey gold grids |
Ultraviolet Ozone Cleaning Systems | UVOCS | model T10X10/OES |