クライオ電子顕微鏡のための単層グラフェン被覆格子の作製

1. グラフェングリッドの作製に必要な材料と付属品の準備 注:グラフェンは容易に汚染されるため、グラフェンコーティングの効率とグラフェングリッドの品質が低下します。したがって、グラフェンと接触するすべての材料を完全に洗浄することが重要です。材料の準備とすべてのステップは、ドラフトに入れておく必要があります。 グリッドをグラフェンでコーティングするために使用する必要な材料を集めます(図2A)。 ガラス器具を脱イオン(DI)水で数回すすぎ、ほこり、糸くず、油性の残留物を取り除きます。 使い捨てワイプを使用してガラスカバーガラスを75%エタノールで洗浄し、エアダスターを使用して汚染物質を取り除きます。注:このプロトコルで使用されるクランプTEMグリッドホルダーブロックは、最大45グリッドを保持できます。グラフェングリッドの大量生産の場合、一度に45グリッド以下を準備できます。ただし、ラボでメソッドが確立されるまでは、小ロット生産(4〜6グリッド)から始めることをお勧めします。 2. 水中での0.2 M過硫酸アンモニウム(APS)の調製 注:このAPS溶液は、後のステップでグラフェン/Cuシートから銅(Cu)担体を除去するためのエッチング液として使用されます。常に新しいものを準備してください APS ソリューション。再利用された溶液や古い溶液は、銅を効果的にエッチングできず、後のステップでグラフェンに銅の残留物を残す可能性があります。 500 mLフラスコを脱イオン水(DI)水ですすぎ、200 mLの脱イオン水と電子レンジを最大設定で約1分間加え、水を脱気します。 200 mLの脱イオン水に9gの過硫酸アンモニウムを加えて、0.2 M APSの溶液を生成します。注意: APSは有毒であり、取り扱うときは個人用保護具(PPE)を着用することをお勧めします APS.処分する APS 廃棄物は、承認された廃棄物処理プラントで。 マグネチックスターラーの攪拌子で溶液を攪拌し、フラスコをドラフトの下の真空源に接続します。注:APS溶液を脱気すると、気泡の形成を防ぐのに役立ち、ステップ6でのCuエッチングの効率が低下する可能性があります。 3.グラフェン/銅をあぶらとり紙できれいなカバーガラスに転写します 注:グラフェンサプライヤーのCu上に15 x 15 cmの化学気相成長(CVD)グラフェンフィルムを使用しています。市販の単層グラフェン/Cuシートは、真空下で保管する必要があります。グラフェンはCVD法によってCuの両面で成長するため、グラフェンサプライヤーは通常、品質チェックを行い、より良い面の使用を推奨します。このプロトコルでは、グラフェンのこの推奨側を「上側」、反対側を「裏側」と呼びます。 あぶらとり紙を約20mm×40mmの長方形にカットします。この吸い取り紙は、グラフェン/Cuシートのパッドとして使用され、グラフェン/Cuシートのコーティングに使用される過剰なメタクリル酸メチル(MMA(8.5)MMA EL6)を吸収します。そのため、使用するグラフェン/Cuシートよりも大きなサイズにカットしてください。 ポリイミドテープを使用して、あぶらとり紙の四隅を、自家製のスピンコーターに収まる清潔なカバーガラスの上部にテープで貼り付けます。注:ポリイミドテープは薄く、簡単に剥がすことができるため、取り扱いが容易です。 グラフェン/銅シートを真空貯蔵庫から1枚取り出します。 清潔でほこりのないはさみを使用して、準備するグリッドの数を完全に覆うのに十分なCuグラフェンシートの小さな正方形を慎重にカットします。たとえば、5 x 5 の配列に配置された 25 個のグリッドの場合、18 mm x 18 mm のピースをカットします。グラフェン/Cuシートを、清潔で乾いたピンセットで吸い取り紙の上に置きます。グラフェン/Cuシートの裏面が下を向いていることを確認し、上面と裏面の区別がつきにくいため、誤ってグラフェン/Cuシートをひっくり返さないように注意してください。 グラフェン/Cuシートの四隅を吸い取り紙/カバーガラスにテープで貼り付け、テープで覆われた領域は次のステップでMMAで覆われないため、テープとグラフェン/Cuシートの間の接触量を最小限に抑えます。注意: 静電気放電はグラフェンフィルムを損傷する可能性があるため、グラフェンまたはグラフェングリッドを取り扱うときは、電気的に接地された状態を維持し、静電気の蓄積を最小限に抑えることをお勧めします。これは、グラフェンまたはグラフェングリッドを取り扱う直前に、静電気リストストラップを着用するか、接地された金属物体に触れることで実現できます。 4.単層グラフェン/ CuシートにMMA(8.5)MMA EL6(MMA)の薄層をコーティングします 注:Cuがエッチングされた後、MMAのこの層はグラフェン単層をサポートし、将来のステップでグラフェンシートの取り扱いを可能にします。MMAコーティングは、グラフェンの単層だけでは透明になるため、グラフェン膜の可視化も可能にします。 Hanらが以前に説明したように、テープで留められたグラフェン/Cuシートの入ったカバーガラスを、ヒュームフード内の自家製スピンコーター(これはコンピューターファンを使用して組み立てることができます)に置きます(図2B)。 安全ゴーグルを着用し、グラフェンシートにガラスピペットを使用してMMAを2滴加えると、すぐに最高速度で回転し始めます。 回転させながら、中央にさらに2滴加えます。1分間回転させます。注:グラフェンを完全にコーティングするのに十分なMMAが塗布されていることを確認してください。よくわからない場合は、さらに数滴追加します。グラフェンが完全にコーティングされていない場合、Cuがエッチングされた後に膜に「穴」が現れます。 ドラフト内で10分間風乾します。 5. グラフェン/Cuシート裏面のグラフェンを除去する 注:銅の裏側(MMAでコーティングされていない面)で成長したグラフェンは、この過剰なグラフェンがCuエッチングの有効性を低下させるため、後続のステップに進む前に除去する必要があります。このグラフェンをプラズマに曝露することでこのグラフェンを除去しますが、これは、生物学的サンプル調製用のEMグリッドを準備するために通常使用されるグロー放電装置を使用して行うことができます。 テープを慎重にはがし、MMAコーティングされたグラフェン/Cuシートを清潔で乾いたピンセットでカバーガラスから持ち上げます。 MMA /グラフェン/ Cuシートの部分を、MMA面を下にして、清潔でほこりのないガラスカバーガラスにテープで貼り付けます。 MMA/グラフェン/Cuシートを含むカバーガラスをグロー放電装置に挿入し、ネガティブ染色またはクライオ電子顕微鏡サンプル調製のグリッドを準備する際に通常使用される設定を適用します。注意: グラフェンフィルム上の酸化銅(CuO)(ナノ)粒子の汚染につながる可能性のある裏面のCuの酸化を防ぐために、長時間のグロー放電は避ける必要があります。 6. APS溶液中のMMA/グラフェン/CuシートからCuをエッチングします。 ドラフト内で、作りたてのAPS溶液200 mLを清潔でほこりのない結晶化皿(150 x 75 mm)に注ぎます。 MMA/グラフェン/Cuシートをスライドガラスから取り除きます。どちらの側にMMAが含まれているかを追跡します。 エッチングを開始するには、プラズマ処理されたCu面を下にしてMMA/グラフェン/CuシートをAPS溶液の表面に置きます。幅広のガラスビーカーをアルミホイルまたは蓋で覆い、ほこりが入らないようにします。 3時間インキュベートします。1時間経ってもCuの大部分がエッチングされない場合は、セクション2〜6の手順を繰り返してから、次の手順に進みます。注:1時間経ってもCuの大部分がエッチングされない場合は、膜のMMA/グラフェン側がCu側ではなくAPS溶液の表面に配置されている可能性があります。Cuは3時間後に完全にエッチングする必要があり、Cuが完全にエッチングされた場合、MMA/グラフェン膜は無色です。グラフェンは汚染しやすいため、グラフェンの品質に悪影響を与えるため、表面に糸くずや脂っこい残留物が蓄積しないように、必ず容器を覆ってください。 7. MMA/グラフェンフィルムを脱イオン水ですすいでください ドラフトで、清潔でほこりのない結晶化皿に脱イオン水を入れます。 APS溶液の表面に対して~45°の角度で配置された清潔でほこりのないガラスカバーガラスで、グラフェンMMAフィルムをそっとすくい上げます。 スライドガラスを水に対してほぼ90°の角度で配置し、MMA/グラフェンがスライドからゆっくりと滑り落ちて水面に浮かぶように、ガラスカバーガラスを水中にそっと下ろします。 MMA/グラフェンフィルムを水面に1時間置いて、APSを洗い流します。 8.グラフェンの単層でコーティングするグリッドをきれいにします 注:グラフェンがグリッドフォイル表面に付着する最大限に活用するには、グラフェンの転写先となるグリッドをできるだけきれいにする必要があります。市販のグリッドには、グラフェンを転写する前に除去しなければならない残留汚染物質が含まれていることがよくあります。 3つの結晶皿をきれいにして乾かし、ほこりがないようにします。 ドラフト内で、200 mLのクロロホルム、アセトン、イソプロピルアルコール(IPA)を3つの結晶化皿のそれぞれに注ぎます。結晶化皿をアルミホイルで覆い、有機溶媒の蒸発を最小限に抑えます。注意: クロロホルムとアセトンは皮膚の炎症を引き起こし、吸入すると有毒になる可能性があります。これらの有機溶剤への曝露を制限し、PPEを着用してください。 200 mLのクロロホルムを含む最初の結晶化ディッシュの底に、クランプTEMグリッドホルダーブロックのベースを置きます。 各グリッドをグリッドボックスからグリッドホルダーブロックのウェルに個別に移し、有窓フィルム側が上を向いていることを確認します。結晶化皿をアルミホイルで覆い、オービタルシェーカーの上に置き、30分間静かに振とうします。 金属製の蓋をグリッドホルダーブロックに置き、次の結晶化ディッシュへの移し替え中にグリッドを固定します。曲がったフォークと長いピンセットでグリッドホルダーブロックを結晶化皿から慎重に持ち上げ、200 mLのアセトンを含む2番目の結晶化皿の底に置きます。グリッドホルダーブロックから蓋を外し、オービタルシェーカーで30分間静かに振る。 グリッドホルダーブロックに蓋を置き、200 mLのIPA溶液を含む結晶化皿に移して、アセトン残留物を取り除きます。グリッドホルダーブロックから蓋を外し、20分間静かに振とうします。 グリッドホルダーブロックから有窓フィルム面を上に向けてグリッドを、あぶらとり紙で覆われたガラスシャーレに個別に移します。 ドラフトの下でグリッドを少なくとも30分間乾燥させ、ほこりがグリッドに付着しないようにグリッドが覆われていることを確認します。 9.きれいなグリッドを、脱イオン水の下のステンレス鋼の金網または穴あきトレイに置かれた吸い取り紙に移します 注:グリッドは、グラフェンを水に浮かべてグリッドに降ろすことができるように、平らな面のDI水の下に沈める必要があります。これは、Palovcakらによって記述されているように、市販のグリッドコーティングトラフを使用して、または酸化グラフェングリッドを生成するために使用されるペトリ皿と蠕動ポンプを使用して実行できます18。 ステンレス鋼のメッシュまたはトレイをグリッドコーティングトラフに置き、純水ですすいでください。 ステンレス製のメッシュ/トレイより少し小さい吸い取り紙を切り、脱イオン水に浸してプラットフォームの上に置きます。注:あぶらとり紙は、移動と取り扱いを可能にするためにプラットフォームよりもわずかに小さくなっています。 洗浄したグリッドを、あぶらとり紙の上に有窓フィルム面を上にして静かに移します。グリッドは疎水性である可能性が高いため、グリッドを垂直に水に沈めるか、水の張力により曲がる可能性があります。グリッドを正方形の配列に配置して、互いにできるだけ近づけますが、重なり合わないようにします(図2C)。 これで、グリッドをグラフェン単分子膜でコーティングする準備が整いました。水面がグリッドから少なくとも5mm上になるように、グリッドコーティングトラフにさらにDI水を入れます。 10. グラフェンをグリッドに転写する グラフェンフィルムから少し離れた角度でゆっくりとトラフにカバーガラスを下げて、きれいなカバーガラスで結晶化皿からMMA/グラフェンフィルムを慎重にすくい取ります。シートとカバーガラスの端が平行になるようにカバーガラスをグラフェンMMAシートの下に置き、カバーガラスを水から垂直に持ち上げて、MMA /グラフェンフィルムを持ってきます。 MMA/グラフェンフィルムがカバーガラスから剥がれて水面に浮かぶように、カバーガラスを~45°の角度で水中に下げて、MMA/グラフェンフィルムをトラフに移します。 水位が下がる前に、MMA/グラフェンフィルムをグリッドの真上に配置します。先端を溶かしたガラス製のパスツールピペットを使用して開口部を密閉し、MMA/グラフェンフィルムの位置を慎重に操作します。 シリンジで水位を約1.25 mL/分でゆっくりと下げ、MMA/グラフェンフィルムがろ紙に着地するときにグリッド表面を完全に覆うようにします注:水位が下がったときにグリッド上の位置を維持するために、グラフェンMMAシートをさらに操作する必要がある場合があります。 清潔で乾いたピンセットを使用して、グリッドを保持している吸い取り紙を持ち上げて、清潔で乾燥したほこりのないペトリ皿に入れるか、ステンレス鋼のプラットフォーム全体を移します。 ドラフトの下でMMA/グラフェングリッドを少なくとも30分間風乾します。ほこりの粒子による汚染を防ぐために、グリッドをアルミホイルまたは蓋で覆ってください。 グリッドをインキュベーターに移し、65°Cのインキュベーターで30分間焼きます。 インキュベーターからグリッドを取り外し、室温で5分間蓋をして、グリッドを室温まで冷却します。 11. MMAの取り外しとグリッドのクリーニング 注:グラフェンでコーティングされたグリッドにMMAが残るのを防ぐために、MMAはアセトンで完全に洗い流す必要があります。 ドラフト内で、室温で200 mLのアセトンを含む2つの晶析皿と200 mLのイソプロパノール(IPA)を含む1つの晶析皿を準備します。結晶化皿をアルミホイルで覆い、有機溶媒の蒸発を最小限に抑えます。注意: アセトンは皮膚の炎症を引き起こす可能性があり、吸入すると有害である可能性があるため、アセトンを取り扱うときはPPEを着用してください。 クランプTEMグリッドホルダーブロックのベースを、200 mLの新鮮なアセトンを含む最初の結晶化ディッシュの底に置きます。 あぶらとり紙からグリッドホルダーブロックのウェルに各グリッドを個別に移し、MMA側が上を向いていることを確認します。結晶化皿をホイルで覆い、オービタルシェーカーの上に置き、30分間静かに振とうします。 金属製の蓋をグリッドホルダーブロックに置き、次の結晶化ディッシュへの移し替え中にグリッドを固定します。曲がったフォークと長いピンセットでグリッドホルダーブロックを結晶化皿から慎重に持ち上げ、200 mLの新鮮なアセトンが入った2番目の結晶化皿の底に置きます。グリッドホルダーブロックから蓋を外し、オービタルシェーカーで30分間静かに振る。 グリッドホルダーブロックに蓋を置き、200 mLのIPA溶液を入れた結晶化皿に移して、アセトン残留物を取り除きます。グリッドホルダーブロックから蓋を外し、20分間静かに振とうします。 あぶらとり紙で覆われた小さなガラスシャーレにグリッドを移し、少なくとも10分間風乾します。ほこりの粒子による汚染を防ぐために、グリッドを蓋で覆ったままにしてください。 グリッドは、真空デシケーター内でアルミホイルで包まれたグリッドボックスに使用または移す準備ができています。注:真空デシケーター内にグラフェングリッドを保管すると、周囲条件による疎水性粒子の汚染を防ぐことができます。これらのグリッドは、使用前に最大数か月間保存できます27。 12. UV/オゾン処理によるグラフェングリッドの親水性化 注:グラフェンは非常に疎水性であり、ブロットプランジアプローチでは、サンプルの滴が均一に広がる親水性の表面を必要とするため、クライオ電子顕微鏡サンプル調製には適していません。従来のグロー放電デバイスは、プラズマを穏やかにパルスさせてグラフェン表面を親水性にするように構成できますが、これらのデバイスは薄いグラフェン単層を破壊する傾向があります。UV/オゾンクリーナーを使用してグラフェン25の表面に部分的に酸素を供給し、単層を損傷することなくクライオ電子顕微鏡サンプル調製に親水性にできることが以前に示されました。 プライミングが必要なUV /オゾンシステムを使用している場合は、システムの電源を入れ、ランプを10分間プライミングします(このステップでは、グリッドが露出していないことを確認してください)。UV /オゾンクリーナーがプライミングされている間に、真空デシケーターからグリッドを取り外し、きれいなカバーガラスに移します。 UV/オゾンシステムの準備ができたら、グラフェン面を上にしてグリッドを含むカバーガラスをUV/オゾンクリーナーに置き、グリッドをオゾンガスに4分間さらします。 オゾンに曝露した後は、すぐにグリッドを使用してクライオ電子顕微鏡サンプルを調製してください。注:プライミングが必要なUV/オゾンシステムを使用する場合は、ランプを10分間プライミングした直後にグリッドをクリーナーに入れる必要があります。グリッドをオゾンガスに6分以上さらすと、グラフェン層が破壊されますので、やめてください。