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Biology

Herstellung von einlagigen Graphen-beschichteten Gittern für die Kryoelektronenmikroskopie

Published: September 08, 2023
doi:
10.3791/65702
, , ,
1Department of Structural and Computational Biology,Scripps Research

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Auftragen einer einzelnen Monoschicht aus Graphen auf Elektronenmikroskopie-Gitter und wie sie für die Verwendung in der KryoEM-Strukturbestimmung vorbereitet werden können.

Abstract

Die kryogene Elektronenmikroskopie (KryoEM) hat sich als leistungsfähige Technik zur Untersuchung der atomaren Struktur makromolekularer Komplexe erwiesen. Die Probenvorbereitung für die KryoEM erfordert die Konservierung der Proben in einer dünnen Schicht aus glasartigem Eis, die in der Regel in den Löchern einer gefensterten Trägerfolie aufgehängt ist. Alle gängigen Probenvorbereitungsansätze für KryoEM-Studien setzen die Probe jedoch der Luft-Wasser-Grenzfläche aus, was zu einem starken hydrophoben Effekt auf die Probe führt, der häufig zu Denaturierung, Aggregation und komplexer Dissoziation führt. Darüber hinaus beeinflussen bevorzugte hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Regionen der Probe und der Luft-Wasser-Grenzfläche die Orientierungen der Makromoleküle, was zu 3D-Rekonstruktionen mit anisotroper Richtungsauflösung führt.

Es hat sich gezeigt, dass die Adsorption von KryoEM-Proben an einer Monoschicht aus Graphen dazu beiträgt, Wechselwirkungen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche zu mildern und gleichzeitig die Einführung von Hintergrundrauschen zu minimieren. Graphenträger bieten auch den Vorteil, dass sie die erforderliche Konzentration von Proteinen, die für die KryoEM-Bildgebung erforderlich sind, erheblich senken. Trotz der Vorteile dieser Stützen werden graphenbeschichtete Gitter aufgrund der unerschwinglichen Kosten für kommerzielle Optionen und der Herausforderungen, die mit der hauseigenen Produktion in großem Maßstab verbunden sind, von der KryoEM-Community nicht häufig verwendet. In diesem Artikel wird eine effiziente Methode zur Herstellung von Chargen von KryoEM-Gittern beschrieben, die eine nahezu vollständige Abdeckung mit einlagigem Graphen aufweisen.

Introduction

Die kryogene Einzelpartikel-Elektronenmikroskopie (KryoEM) ist eine zunehmend anwendbare Technologie zur Untersuchung der 3D-Strukturen von Biomakromolekülen. Technologische Fortschritte in der Elektronenmikroskopoptik, der direkten Elektronendetektion1 und Computeralgorithmen 2,3,4 haben es in den letzten zehn Jahren ermöglicht, KryoEM-Anwender in die Lage zu versetzen, die Strukturen biochemisch stabiler makromolekularer Komplexe mit nahezu atomarer Auflösung zu bestimmen 5,6,7,8 . Trotz dieser Fortschritte gibt es nach wie vor erhebliche Hindernisse für die Konservierung von Proben für die KryoEM-Bildgebung, die verhindern, dass die meisten biologischen Proben mit so hohen Auflösungen aufgelöst werden können.

Bei der Probenvorbereitung für die hochauflösende KryoEM-Analyse werden Makromoleküle, die gleichmäßig in einer Vielzahl von Orientierungen verteilt sind, in einer dünnen Schicht aus verglastem Eis eingefangen. Die “Blot-and-Plunge”-Methoden des Einfrierens sind die am weitesten verbreiteten Methoden, um dünne Schichten biologischer Proben auf Gittern für KryoEM-Studien zu erzeugen 9,10. Bei diesen Verfahren werden einige Mikroliter Probenlösung auf ein EM-Gitter aufgebracht, das einen gefensterten Film enthält, der hydrophil gemacht wurde, und anschließend wird der größte Teil der Probe mit Filterpapier abgetupft, bevor das Gitter schnell in ein Kryogen aus flüssigem Ethan oder Ethan-Propan-Gemisch9 getaucht wird.

Während diese Methode erfolgreich zur Strukturbestimmung eines breiten Spektrums biologischer Proben eingesetzt wurde, setzen alle gängigen KryoEM-Probenvorbereitungsmethoden die Proben der hydrophoben Luft-Wasser-Grenzfläche (AWI) aus, was häufig Probleme mit sich bringt, die die hochauflösende Strukturbestimmung einschränken. Es ist erwiesen, dass biologische Proben eine hohe Neigung zur Denaturierung aufweisen, wenn sie dem AWI ausgesetzt sind, was zu einer komplexen Aggregation und Zerlegung führen kann11,12,13,14. Darüber hinaus bewirken hydrophobe Flecken auf den Oberflächen biologischer Proben, dass Partikel bevorzugte Orientierungen im Eis einnehmen12. In vielen Szenarien zwingt eine einzige hydrophobe Region der Probe alle Partikel dazu, eine singuläre Orientierung im Eis einzunehmen, wodurch die Fähigkeit, eine zuverlässige Rekonstruktion zu erzeugen, aufgehoben wird. Zusätzlich zu den Problemen mit dem AWI können die Proben eine Affinität zur Oberfläche der gefensterten Filmschicht aufweisen, wodurch die Anzahl der im Eis suspendierten Partikel innerhalb der Löcher15 begrenzt wird.

Es wurden verschiedene methodische und technologische Lösungen entwickelt, um diese Probleme, die sich aus Interaktionen mit dem AWI oder den Filmen ergeben, zu verringern16,17. Ein beliebter Ansatz besteht darin, die gefensterte Folie der EM-Gitter mit einer dünnen (zehn Nanometer) Schicht aus amorphem Kohlenstoff zu beschichten. Diese Beschichtung bietet eine durchgehende Oberfläche über die Löcher, an die Partikel adsorbieren können, mit dem Vorteil, dass die Probe teilweise vor Wechselwirkungen mit dem AWIabgeschirmt wird 15,18,19,20. Die zusätzliche Kohlenstoffschicht erhöht jedoch die Menge des Hintergrundsignals in den abgebildeten Bereichen und führt zu Rauschen, das die erreichbare Auflösung beeinträchtigen kann, insbesondere bei kleinen (<150 kDa) Proben. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass die Verwendung von Graphenoxid (GO)-Flocken zur Herstellung von Trägerfilmen auf KryoEM-Gittern Vorteile gegenüber herkömmlichem amorphem Kohlenstoff hat. GO-Flocken werden durch die Oxidation von Graphitschichten hergestellt, was zu pseudokristallinen Schichten aus einschichtigem Graphit führt, die aufgrund ihres hohen Sauerstoffgehalts in Form von Carboxyl-, Hydroxyl- und Epoxidgruppen an den Oberflächen und Kanten hydrophil sind. Kommerzielle GO-Flocken in wässrigen Suspensionen sind kostengünstig, und es gibt zahlreiche veröffentlichte Verfahren zum Auftragen von GO-Flocken auf EM-Gitter18,21. Diese Methoden führen jedoch häufig zu Gittern, die nur teilweise mit GO-Flocken bedeckt sind, sowie zu Bereichen, die mehrere Schichten von GO-Flocken enthalten. Darüber hinaus tragen GO-Flocken zu KryoEM-Bildern ein wahrnehmbares Hintergrundsignal bei, das dem von dünnem amorphem Kohlenstoff22,23 nahe kommt.

Reines einschichtiges Graphen, das aus einem einzigen kristallinen 2D-Array von Kohlenstoffatomen besteht, unterscheidet sich von GO dadurch, dass es im Elektronenmikroskop keinen Phasenkontrast erzeugt. Monolagiges Graphen kann somit verwendet werden, um eine unsichtbare Trägerschicht für die Abbildung biologischer Proben zu erzeugen. Monolayer-Graphen ist auch stärker als GO und kann als einzelne Monoschicht auf ein EM-Gitter aufgetragen werden, und die jüngsten Fortschritte bei der Herstellung von Graphen-beschichteten EM-Gittern haben es ermöglicht, einschichtige Graphengitter mit hoher Abdeckung im eigenen Haus herzustellen 24,25,26,27,28,29,30. Trotz der Vorteile der Verwendung von graphenbeschichteten Gittern für die Bestimmung der KryoEM-Struktur sind sie aufgrund der unerschwinglichen Kosten kommerzieller Optionen und der Komplexität der internen Produktion nicht weit verbreitet. Hier beschreiben wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur effektiven Herstellung von EM-Gittern, die mit einer Monoschicht aus Graphen bedeckt sind, für die KryoEM-Strukturbestimmung biologischer Proben (Abbildung 1). Durch die Befolgung dieses detaillierten Protokolls können KryoEM-Forscher an einem einzigen Tag Dutzende von hochwertigen Graphen-Trägergittern reproduzierbar herstellen. Die Qualität der graphenbeschichteten Gitter kann mit einem Low-End-Transmissionselektronenmikroskop (TEM), das mit einem LaB6-Filament ausgestattet ist, leicht untersucht werden.

Protocol

1. Vorbereitung von Materialien und Zubehör, die für die Herstellung von Graphengittern erforderlich sind HINWEIS: Graphen verunreinigt leicht, was die Effizienz der Graphenbeschichtung und die Qualität der Graphengitter verringert; Daher ist es wichtig, alle Materialien, die mit dem Graphen in Berührung kommen, gründlich zu reinigen. Die Vorbereitung der Materialien und alle Schritte sollten in einem Abzug durchgeführt werden. Sammeln Sie die notwendigen Materialien, die für die Beschichtung der Gitter mit Graphen verwendet werden (Abbildung 2A). Spülen Sie die Gläser mehrmals mit deionisiertem Wasser (DI) ab, um Staub, Flusen und ölige Rückstände zu entfernen. Verwenden Sie Einwegtücher, um Glasdeckgläser mit 75 % Ethanol zu reinigen, und verwenden Sie einen Staubwedel, um Verunreinigungen zu entfernen.ANMERKUNG: Der in diesem Protokoll verwendete Klemm-TEM-Gitterhalterblock kann bis zu 45 Gitter aufnehmen. Für eine Großserienproduktion von Graphengittern können 45 Gitter oder weniger auf einmal hergestellt werden. Es wird jedoch empfohlen, mit einer Kleinserienproduktion (vier bis sechs Gitter) zu beginnen, bis sich die Methode im Labor etabliert hat. 2. Herstellung von 0,2 M Ammoniumpersulfat (APS) in Wasser HINWEIS: Diese APS-Lösung wird als Ätzmittel verwendet, um in einem späteren Schritt den Kupfer (Cu)-Träger von der Graphen-/Cu-Folie zu entfernen. Bereiten Sie immer eine frische APS-Lösung vor. Wiederverwendete oder alte Lösungen werden Kupfer nicht effektiv ätzen und können in den späteren Schritten Kupferrückstände auf dem Graphen hinterlassen. Spülen Sie einen 500-ml-Kolben mit deionisiertem Wasser (DI) aus, fügen Sie dann 200 ml DI-Wasser hinzu und erhitzen Sie es bei maximaler Einstellung etwa 1 Minute lang, um das Wasser zu entgasen. 9 g Ammoniumpersulfat werden zu 200 ml DI-Wasser gegeben, um eine Lösung von 0,2 M APS zu erhalten.VORSICHT: APS ist giftig, es wird empfohlen, beim Umgang mit APS persönliche Schutzausrüstung (PSA) zu tragen. Entsorgen Sie APS-Abfälle in einer zugelassenen Entsorgungsanlage. Rühren Sie die Lösung mit einem Rührstab an einem Magnetrührer um, während Sie den Kolben an eine Vakuumquelle unter einem Abzug anschließen.HINWEIS: Die Entgasung der APS-Lösung hilft, die Bildung von Blasen zu verhindern, die die Effizienz des Cu-Ätzens in Schritt 6 verringern können. 3. Geben Sie Graphen/Kupfer mit einem Stück Löschpapier auf ein sauberes Deckglas HINWEIS: Wir verwenden eine 15 x 15 cm große Graphenfolie mit chemischer Gasphasenabscheidung (CVD) auf Cu von einem Graphenlieferanten. Im Handel erhältliche einlagige Graphen-/Cu-Platten sollten unter Vakuum gelagert werden. Da Graphen auf beiden Seiten von Cu mit der CVD-Methode gezüchtet wird, führen Graphenlieferanten in der Regel Qualitätskontrollen durch und empfehlen die bessere Seite für die Verwendung. Wir bezeichnen diese empfohlene Seite des Graphens in diesem Protokoll als “obere” Seite, während die andere Seite die “hintere” Seite ist. Schneiden Sie ein Stück Löschpapier in eine rechteckige Form von ca. 20 mm x 40 mm. Dieses Löschpapier wird als Polsterung für die Graphen-/Cu-Folie verwendet und absorbiert überschüssiges Methylmethacrylat (MMA (8.5) MMA EL6), das zur Beschichtung der Graphen-/Cu-Folie verwendet wird. Achten Sie daher darauf, es auf eine Größe zu schneiden, die größer ist als die zu verwendende Graphen-/Cu-Folie. Verwende Polyimid-Klebeband, um die vier Ecken des Löschpapiers auf ein sauberes Deckglas zu kleben, das in einen selbstgebauten Spin Coater passt.HINWEIS: Polyimidband wird verwendet, weil es dünn ist und leicht entfernt werden kann, was die Handhabung erleichtert. Nehmen Sie ein Stück der Graphen-/Cu-Folie aus dem Vakuumlager. Schneiden Sie mit einer sauberen und staubfreien Schere vorsichtig ein kleines Quadrat aus der Cu-Graphen-Folie, das ausreicht, um die Anzahl der vorzubereitenden Gitter vollständig abzudecken. Schneiden Sie beispielsweise für 25 Raster, die in einem 5 x 5-Array angeordnet sind, ein Stück mit den Maßen 18 mm x 18 mm zu. Lege die Graphen-/Cu-Folie mit einer sauberen, trockenen Pinzette auf das Löschpapier. Stellen Sie sicher, dass die Rückseite der Graphen-/Cu-Folie nach unten zeigt, und achten Sie darauf, dass Sie die Graphen-/Cu-Folie nicht versehentlich umdrehen, da es schwierig ist, die Oberseite von der Rückseite zu unterscheiden. Klebe die vier Ecken des Graphen-/Cu-Blattes auf das Löschpapier/Deckglas, um den Kontakt zwischen dem Klebeband und dem Graphen-/Cu-Blatt zu minimieren, da alle mit Klebeband bedeckten Bereiche im nächsten Schritt nicht mit MMA abgedeckt werden.HINWEIS: Statische Entladungen können Graphenfilme beschädigen, daher ist es ratsam, elektrisch geerdet zu bleiben und die Ansammlung statischer Aufladung beim Umgang mit Graphen oder Graphengittern zu minimieren. Dies kann erreicht werden, indem ein Erdungsband am Handgelenk getragen oder ein geerdetes Metallobjekt unmittelbar vor der Handhabung von Graphen oder Graphengittern berührt wird. 4. Beschichten Sie die einlagige Graphen-/Cu-Folie mit einer dünnen Schicht MMA(8,5)MMA EL6 (MMA) HINWEIS: Nachdem das Cu weggeätzt wurde, unterstützt diese MMA-Schicht die Graphen-Monoschicht, um die Handhabung der Graphenschicht in zukünftigen Schritten zu ermöglichen. Die MMA-Beschichtung ermöglicht auch die Visualisierung des Graphenfilms, da eine Monoschicht aus Graphen allein transparent wäre. Legen Sie das Deckglas mit der abgeklebten Graphen-/Cu-Folie auf einen selbstgebauten Spin Coater (dieser kann mit einem Computerlüfter zusammengebaut werden) in einen Abzug (Abbildung 2B), wie zuvor von Han et al.25 beschrieben. Tragen Sie eine Schutzbrille, geben Sie zwei Tropfen MMA mit einer Glaspipette auf das Graphenblatt und beginnen Sie sofort mit maximaler Geschwindigkeit. Während des Schleuderns zwei weitere Tropfen in die Mitte geben. 1 Min. schleudern.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass genügend MMA aufgetragen wurde, um das Graphen vollständig zu beschichten. Wenn Sie sich unsicher sind, fügen Sie noch ein paar Tropfen hinzu. Wenn Graphen nicht vollständig beschichtet ist, entstehen “Löcher” in der Folie, nachdem Cu weggeätzt wurde. 10 Minuten in einem Abzug an der Luft trocknen lassen. 5. Entfernen Sie Graphen auf der Rückseite der Graphen-/Cu-Folie HINWEIS: Graphen, das auf der Rückseite des Kupfers gewachsen ist (die Seite, die nicht mit MMA beschichtet ist), muss entfernt werden, bevor Sie mit den nachfolgenden Schritten fortfahren, da dieses überschüssige Graphen die Wirksamkeit des Cu-Ätzens verringert. Wir entfernen dieses Graphen, indem wir das Graphen Plasma aussetzen, was mit jedem Glimmentladungsgerät erreicht werden kann, das typischerweise zur Vorbereitung von EM-Gittern für die biologische Probenvorbereitung verwendet wird. Entfernen Sie das Klebeband vorsichtig und heben Sie die MMA-beschichtete Graphen/Cu-Folie mit einer sauberen, trockenen Pinzette aus dem Deckglas. Klebe das Stück des MMA/Graphen/Cu-Blattes mit der MMA-Seite nach unten auf ein sauberes und staubfreies Deckglas. Legen Sie das Deckglas mit der MMA-/Graphen-/Cu-Folie in das Glimmentladungsgerät und wenden Sie Einstellungen an, die normalerweise bei der Vorbereitung von Gittern für die Negativfärbung oder die KryoEM-Probenvorbereitung verwendet werden.HINWEIS: Eine längere Glimmentladung sollte vermieden werden, um eine Oxidation von Cu auf der Rückseite zu verhindern, die zu einer Kontamination von Kupferoxid (CuO) (Nano-)Partikeln auf der Graphenfolie führen kann. 6. Ätzen Sie das Cu aus dem MMA/Graphen/Cu-Blatt in der APS-Lösung weg In einem Abzug 200 ml der frisch hergestellten APS-Lösung in eine saubere und staubfreie Kristallisationsschale (150 x 75 mm) geben. Entferne die MMA/Graphen/Cu-Folie vom Objektträger. Behalte den Überblick, auf welcher Seite sich das MMA befindet. Um mit dem Ätzen zu beginnen, legen Sie das MMA/Graphen/Cu-Blatt mit der plasmabehandelten Cu-Seite nach unten auf die Oberfläche der APS-Lösung. Decken Sie den breiten Glasbecher mit einem Stück Alufolie oder einem Deckel ab, um das Eindringen von Staub zu verhindern. 3 h inkubieren. Wenn der größte Teil des Cu nach 1 h noch nicht geätzt ist, wiederholen Sie die Schritte in den Abschnitten 2-6 und fahren Sie dann mit dem nächsten Schritt fort.HINWEIS: Wenn der größte Teil des Cu nach 1 h nicht geätzt ist, ist es wahrscheinlich, dass die MMA/Graphen-Seite des Films auf die Oberfläche der APS-Lösung statt auf die Cu-Seite gelegt wurde. Cu sollte nach 3 h vollständig geätzt sein, und der MMA/Graphen-Film ist farblos, wenn Cu vollständig geätzt ist. Graphen verunreinigt leicht, also stellen Sie sicher, dass Sie alle Behälter abdecken, um die Ansammlung von Flusen oder fettigen Rückständen auf Oberflächen zu vermeiden, da dies die Qualität des Graphens negativ beeinflusst. 7. Spülen Sie die MMA/Graphen-Folie in DI-Wasser ab Füllen Sie in einem Abzug eine saubere und staubfreie Kristallisationsschale mit DI-Wasser. Schöpfen Sie die Graphen-MMA-Folie vorsichtig mit einem sauberen, staubfreien Deckglas auf, das in einem Winkel von ~45° relativ zur Oberfläche der APS-Lösung positioniert ist. Positionieren Sie den Objektträger in einem Winkel von fast 90° zum Wasser und senken Sie das Glasdeckglas vorsichtig ins Wasser, so dass das MMA/Graphen langsam von der Rutsche gleitet und auf der Wasseroberfläche schwimmt. Lassen Sie die MMA/Graphen-Folie 1 Stunde lang auf der Wasseroberfläche, um APS abzuwaschen. 8. Reinigen Sie die zu beschichtenden Gitter mit einer Monoschicht Graphen HINWEIS: Die Gitter, auf die das Graphen übertragen wird, müssen so sauber wie möglich sein, um die Anhaftung des Graphens an der Oberfläche der Gitterfolie zu maximieren. Kommerziell erworbene Gitter enthalten oft Restverunreinigungen, die vor dem Transfer von Graphen entfernt werden müssen. Reinigen und trocknen Sie drei kristallisierende Schalen, damit sie staubfrei sind. Gießen Sie in einem Abzug 200 ml Chloroform, Aceton und Isopropylalkohol (IPA) in jede der drei kristallisierenden Schalen. Decken Sie die kristallisierenden Schalen mit Aluminiumfolie ab, um die Verdunstung der organischen Lösungsmittel zu minimieren.VORSICHT: Chloroform und Aceton verursachen Hautreizungen und können beim Einatmen giftig sein. Begrenzen Sie die Exposition gegenüber diesen organischen Lösungsmitteln und tragen Sie PSA. Platzieren Sie den Boden des TEM-Gitterhalterblocks auf dem Boden der ersten Kristallisationsschale, die 200 ml Chloroform enthält. Übertragen Sie jedes Gitter einzeln aus der Gitterbox in eine Vertiefung im Gitterhalterblock und stellen Sie sicher, dass die gefensterte Folienseite nach oben zeigt. Decken Sie die Kristallisationsschale mit Aluminiumfolie ab, stellen Sie sie auf einen Orbitalschüttler und schütteln Sie sie 30 Minuten lang vorsichtig. Setzen Sie den Metalldeckel auf den Gitterhalterblock, der die Gitter während des Transfers zur nächsten Kristallisationsschale sichert. Heben Sie den Gitterhalterblock vorsichtig mit einer gebogenen Gabel und einer langen Pinzette aus der Kristallisationsschale und legen Sie ihn auf den Boden der zweiten Kristallisationsschale, die 200 ml Aceton enthält. Nehmen Sie den Deckel vom Gitterhalterblock ab und schütteln Sie ihn vorsichtig 30 Minuten lang auf einem Orbitalschüttler. Setzen Sie den Deckel auf den Gitterhalterblock und geben Sie ihn in eine kristallisierende Schale mit 200 ml IPA-Lösung, um Acetonrückstände zu entfernen. Nehmen Sie den Deckel vom Gitterhalterblock ab und schütteln Sie ihn 20 Minuten lang vorsichtig. Übertragen Sie die Gitter einzeln mit der gefensterten Folienseite nach oben vom Gitterhalterblock in eine mit Löschpapier bedeckte Petrischale aus Glas. Trocknen Sie die Gitter mindestens 30 Minuten lang unter dem Abzug und achten Sie darauf, dass die Gitter abgedeckt sind, um zu verhindern, dass Staub darauf landet. 9. Übertragen Sie die sauberen Gitter auf Löschpapier, das auf ein Edelstahldrahtgeflecht oder eine perforierte Schale unter DI-Wasser gelegt wird HINWEIS: Die Gitter müssen auf einer ebenen Oberfläche unter DI-Wasser getaucht werden, damit das Graphen auf das Wasser schwimmen und auf die Gitter abgesenkt werden kann. Dies kann mit einem handelsüblichen Gitterbeschichtungstrog oder mit einer Petrischale und einer Peristaltikpumpe durchgeführt werden, wie sie zur Erzeugung von Graphenoxidgittern verwendet werden, wie von Palovcak et al.18 beschrieben. Legen Sie das Edelstahlgitter oder die Schale in eine Gitterbeschichtungswanne und spülen Sie es mit DI-Wasser ab. Schneiden Sie das Löschpapier zu, das etwas kleiner ist als das Edelstahlgitter/die Edelstahlschale, und legen Sie es auf die Plattform, die in das DI-Wasser getaucht ist.HINWEIS: Das Löschpapier ist etwas kleiner als die Plattform, um Bewegung und Handhabung zu ermöglichen. Übertragen Sie die gereinigten Gitter vorsichtig mit der gefensterten Folienseite nach oben auf das Löschpapier. Die Gitter werden wahrscheinlich hydrophob sein, also tauchen Sie die Gitter vertikal in das Wasser, da sie sich sonst aufgrund der Wasserspannung verbiegen können. Positionieren Sie die Gitter in einem quadratischen Array so, dass sie so nah wie möglich beieinander liegen, sich aber nicht überlappen (Abbildung 2C). Die Gitter können nun mit einer Graphen-Monolage beschichtet werden. Füllen Sie die Gitterbeschichtungswanne mit mehr DI-Wasser, so dass die Wasseroberfläche mindestens 5 mm über den Gittern liegt. 10. Übertragen Sie Graphen auf die Gitter Schöpfen Sie die MMA/Graphen-Folie vorsichtig mit einem sauberen Deckglas aus der Kristallisationsschale, indem Sie das Deckglas langsam schräg und in einiger Entfernung von der Graphenfolie in die Mulde senken. Positionieren Sie das Deckglas unter der Graphen-MMA-Folie, so dass die Kanten der Folie und des Deckglases parallel sind, und heben Sie dann das Deckglas senkrecht aus dem Wasser, wobei Sie die MMA/Graphen-Folie mitnehmen. Übertragen Sie die MMA/Graphen-Folie in die Mulde, indem Sie das Deckglas in einem Winkel von ~45° ins Wasser senken, so dass sich die MMA/Graphen-Folie vom Deckglas löst und auf der Wasseroberfläche schwimmt. Positionieren Sie die MMA/Graphen-Folie direkt über den Gittern, bevor der Wasserspiegel abgesenkt wird. Verwenden Sie eine Pasteur-Glaspipette, deren Spitze geschmolzen wurde, um die Öffnung zu verschließen, um die Position des MMA/Graphen-Films vorsichtig zu manipulieren. Senken Sie den Wasserstand mit der Spritze langsam auf ca. 1,25 ml/min, so dass der MMA/Graphen-Film die Gitteroberflächen vollständig bedeckt, wenn er auf dem Filterpapier landetHINWEIS: Eine weitere Manipulation der Graphen-MMA-Folie kann erforderlich sein, um ihre Position über den Gittern beizubehalten, wenn der Wasserspiegel sinkt. Verwenden Sie eine saubere, trockene Pinzette, um das Löschpapier, mit dem die Gitter befestigt sind, in eine saubere, trockene und staubfreie Petrischale zu heben, oder übertragen Sie die gesamte Edelstahlplattform. Trocknen Sie die MMA/Graphen-Gitter mindestens 30 Minuten lang unter dem Abzug. Halten Sie die Gitter mit Aluminiumfolie oder einem Deckel bedeckt, um eine Kontamination durch Staubpartikel zu vermeiden. Die Gitter in einen Inkubator geben und in einem 65 °C warmen Inkubator 30 Minuten backen. Nehmen Sie die Gitter aus dem Inkubator und lassen Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur zugedeckt, um die Gitter auf Raumtemperatur abzukühlen. 11. Entfernen von MMA und Reinigen der Gitter HINWEIS: MMA muss gründlich mit Aceton abgewaschen werden, um MMA-Rückstände auf den graphenbeschichteten Gittern zu vermeiden. In einem Abzug zwei Kristallisationsschalen mit 200 ml Aceton und eine Kristallisationsschale mit 200 ml Isopropanol (IPA) bei Raumtemperatur zubereiten. Decken Sie die kristallisierenden Schalen mit Aluminiumfolie ab, um die Verdunstung der organischen Lösungsmittel zu minimieren.VORSICHT: Tragen Sie beim Umgang mit Aceton PSA, da es Hautreizungen verursachen und beim Einatmen schädlich sein kann. Platzieren Sie die Basis des Klemm-TEM-Gitterhalterblocks auf dem Boden der ersten Kristallisationsschale, die 200 ml frisches Aceton enthält. Übertragen Sie jedes Gitter einzeln vom Löschpapier in eine Vertiefung im Gitterhalterblock und stellen Sie sicher, dass die MMA-Seite nach oben zeigt. Decken Sie die Kristallisationsschale mit Folie ab, stellen Sie sie auf einen Orbitalschüttler und schütteln Sie sie 30 Minuten lang vorsichtig. Setzen Sie den Metalldeckel auf den Gitterhalterblock, der die Gitter während des Transfers zur nächsten Kristallisationsschale sichert. Heben Sie den Gitterhalterblock vorsichtig mit einer gebogenen Gabel und einer langen Pinzette aus der Kristallisationsschale und legen Sie ihn auf den Boden der zweiten Kristallisationsschale, die 200 ml frisches Aceton enthält. Nehmen Sie den Deckel vom Gitterhalterblock ab und schütteln Sie ihn vorsichtig 30 Minuten lang auf einem Orbitalschüttler. Setzen Sie den Deckel auf den Gitterhalterblock und geben Sie ihn in die Kristallisationsschale mit 200 ml IPA-Lösung, um Acetonrückstände zu entfernen. Nehmen Sie den Deckel vom Gitterhalterblock ab und schütteln Sie ihn 20 Minuten lang vorsichtig. Die Gitter in eine kleine, mit Löschpapier bedeckte Petrischale geben und mindestens 10 Minuten an der Luft trocknen lassen. Halten Sie die Gitter mit einem Deckel bedeckt, um eine Kontamination durch Staubpartikel zu vermeiden. Die Gitter sind gebrauchsfertig oder können in eine mit Aluminiumfolie umwickelte Gitterbox in einem Vakuumexsikkator überführt werden.HINWEIS: Die Lagerung von Graphengittern in einem Vakuum-Exsikkator kann eine Kontamination hydrophober Partikel durch Umgebungsbedingungen verhindern. Diese Gitter können bis zu mehreren Monaten gelagert werden, bevor sie verwendet werden27. 12. Graphengitter mit UV/Ozon-Behandlung hydrophil machen HINWEIS: Graphen ist extrem hydrophob, was nicht mit der KryoEM-Probenvorbereitung kompatibel ist, da Blot-Plunge-Ansätze eine hydrophile Oberfläche erfordern, auf der sich ein Tropfen der Probe gleichmäßig verteilen kann. Während herkömmliche Glimmentladungsgeräte so konfiguriert werden können, dass sie Plasma sanft pulsieren, um die Graphenoberfläche hydrophil zu machen, neigen diese Geräte dazu, die dünne Graphen-Monoschicht zu zerstören. Es wurde bereits gezeigt, dass ein UV/Ozon-Reiniger verwendet werden kann, um die Oberfläche des Graphens25 teilweise mit Sauerstoff anzureichern, wodurch es für die KryoEM-Probenvorbereitung hydrophil wird, ohne die Monoschicht zu beschädigen. Wenn Sie ein UV/Ozon-System verwenden, das eine Grundierung erfordert, schalten Sie das System ein und entlüften Sie die Lampe 10 Minuten lang (stellen Sie in diesem Schritt sicher, dass keine Gitter freiliegen). Während der UV/Ozon-Reiniger grundiert, entfernen Sie die Gitter aus dem Vakuum-Exsikkator und geben Sie sie in ein sauberes Deckglas. Wenn das UV/Ozon-System bereit ist, legen Sie das Deckglas mit den Gittern mit der Graphenseite nach oben in den UV/Ozon-Reiniger und setzen Sie die Gitter 4 Minuten lang dem Ozongas aus. Verwenden Sie die Gitter nach der Ozonexposition sofort für die KryoEM-Probenvorbereitung.HINWEIS: Wenn Sie ein UV/Ozon-System verwenden, das eine Grundierung erfordert, müssen die Gitter sofort nach dem Grundieren der Lampe für 10 Minuten in den Reiniger gelegt werden, da es sonst zu kühl ist, um genügend Ozongas zu erzeugen, um das Graphen für die Probenvorbereitung mit Sauerstoff anzureichern. Setzen Sie die Gitter nicht länger als 6 Minuten dem Ozongas aus, da dies die Graphenschicht zerstört.

Representative Results

Die erfolgreiche Ausführung des hier beschriebenen Protokolls zur Herstellung von Graphengittern führt zu EM-Gittern, die vollständig mit einer einzigen Monoschicht aus Graphen beschichtet sind. Die Graphenbedeckung der Gitter kann mit jedem TEM überprüft werden. Da eine Monolage aus reinem Graphen im TEM nahezu unsichtbar ist, muss man sie mit dem Beugungsmodus des Mikroskops untersuchen und Bragg-Punkte beobachten, die der hexagonalen Anordnung der Kohlenstoffatome entsprechen, aus denen das Graphen besteht (Abbildung 3A). Es ist normal, gelegentlich einige Falten von einlagigem Graphen zu beobachten, die während der MMA-Beschichtung auftreten (Abbildung 3B). Man kann auch den Grad der Kontamination des Graphens überprüfen, indem man ein Bild mit hoher Vergrößerung in der Mitte eines der mit Graphen bedeckten Löcher aufnimmt (Abbildung 3C). Wenn es mit einem hochauflösenden Detektor aufgenommen wird, sollte eine Fourier-Transformation dieses Bildes Bragg-Punkte enthalten, die einem Kohlenstoff-Kohlenstoff-Abstand bei 2,14 Å entsprechen (Abbildung 4C). Eine Monolage aus Kohlenstoffatomen erzeugt nicht genügend Elektronenstreuung, um einen Phasenkontrast zu erzeugen, und daher zeigt ein Bild von sauberem Graphen keine Thon-Ringe, die mit der Kontrastübertragungsfunktion in einer Fourier-Transformation des Bildes verbunden sind. Es ist jedoch sehr schwierig, eine Kontamination der Graphengitter nach ihrer Herstellung zu verhindern, und ein unzureichendes Waschen der EM-Gitter oder das Entfernen von MMA nach der Graphenbeschichtung führt zu bemerkenswerten Verunreinigungen auf den Gittern, die in den Realraumbildern sichtbar sind (Abbildung 3C). Wie in Abbildung 4 gezeigt, haben Graphengitter eine konzentrierende Wirkung auf eine Probe, wie beim Vergleich von 0,5 mg/ml Apoferritin beobachtet wird, die auf löchrige Goldgitter mit (Abbildung 4A) und ohne Graphenträger (Abbildung 4B) aufgetragen werden. Ähnliche Graphen-Herstellungsprotokolle wurden bereits beschrieben, um KryoEM-Strukturen von Proteinen wie Apoferritin mit hoher Auflösungzu lösen 25,27. Abbildung 1: Schematische Darstellung zur Herstellung von graphenbeschichteten KryoEM-Gittern. Die wichtigsten Schritte im Prozess der Herstellung von Graphengittern werden veranschaulicht. Abkürzungen: cryoEM = kryogene Elektronenmikroskopie; MMA = Methylmethacrylat; APS = Ammoniumpersulfat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Benötigte Materialien für die Herstellung von Graphengittern . (A) Notwendige Materialien für die Beschichtung von Kryo-EM-Gittern sind entsprechend gekennzeichnet. (B) Nahaufnahme des Coaters mit Graphen/Cu-Folie, die auf ein Löschpapier auf einem Objektträger geklebt ist. Der Spin Coater kann durch den Kauf von Teilen in einem lokalen Computer-/Baumarkt zusammengebaut werden. (C) Nahaufnahme der Gitterbeschichtungswanne, die an einer Spritze befestigt ist, mit der der Wasserstand kontrolliert werden kann. Die Gitter werden auf ein Löschpapier auf einem Edelstahlgeflecht gelegt. Das Löschpapier hilft dabei, die Position der Gitter so zu manövrieren, dass die Graphenschicht darauf abgestimmt werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Ein repräsentatives Beugungsmusterbild und Hellfeldbilder eines Graphengitters mit Falten oder MMA-Kontamination . (A) EM-Gitter, die mit einer Monolage aus Graphen bedeckt sind, zeigen Bragg-Peaks, die dem hexagonalen Gitter des Graphens entsprechen, wenn sie in einem TEM im Beugungsmodus abgebildet werden. Der Bragg-Peak, der dem Kohlenstoff-Kohlenstoff-Abstand von 2,14 Å entspricht, ist eingekreist und mit einem Pfeil gekennzeichnet. (B) Ein Hellfeldbild eines einlagigen Graphengitters mit einigen Falten (gekennzeichnet durch einen Pfeil) in der Graphen-Monoschicht. (C) Ein Hellfeldbild von einlagigem Graphen mit MMA-Kontamination (gekennzeichnet mit einem Pfeil). Maßstabsbalken = 100 nm (B,C). Abkürzungen: EM = Elektronenmikroskopie; MMA = Methylmethacrylat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Apoferritin auf mit Graphen bedeckten Goldgittern: (A) KryoEM-Aufnahme von 0,5 mg/ml Apoferritin auf mit Graphen bedeckten Goldgittern. (B) Apoferritin, das in der gleichen Konzentration abgebildet wurde, ist in wesentlich geringerer Konzentration sichtbar, wenn es unter Verwendung von löchrigen Goldgittern ohne Graphen hergestellt wird. (C) FFT der KryoEM-Aufnahme von 0,5 mg/ml Apoferritin auf mit Graphen bedeckten Goldgittern, wobei die Bragg-Peaks dem hexagonalen Graphengitter entsprechen. Maßstabsbalken = 100 nm (A,B). Abkürzungen: cryoEM = kryogene Elektronenmikroskopie; FFT = schnelle Fourier-Transformation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Die Konservierung biologischer Proben in einer dünnen Schicht Glaseis ist ein entscheidender Schritt für die hochauflösende KryoEM-Strukturbestimmung. Die Forscher stoßen jedoch häufig auf Probleme, die sich aus der Interaktion mit dem AWI ergeben, was zu bevorzugter Orientierung, komplexer Zerlegung, Denaturierung und Aggregation führt. Darüber hinaus können die Proben nicht immer ausreichend konzentriert werden, um das dünne Eis zu besiedeln, das über den Löchern einer gefensterten Folie hängt. Mehrere Forschungsgruppen haben Methoden entwickelt, um EM-Gitter mit einer Monoschicht aus Graphen zu beschichten, um einige dieser Einschränkungen zu überwinden 24,25,26,27,28,29,30, und Graphengitter wurden mit großem Erfolg eingesetzt. Hier stellen wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Verfügung, wie Sie Chargen von Graphengittern effektiv im eigenen Haus vorbereiten und die Qualität der Graphengitter mittels TEM untersuchen können. Wir betonen, dass bei einigen der kritischen Schritte, die wir im Folgenden skizzieren, besondere Vorsicht geboten ist.

Graphen hat eine starke Tendenz, Luftschadstoffe anzuziehen. Daher ist es wichtig, während des Herstellungsprozesses des Graphengitters sicherzustellen, dass alle Werkzeuge, die mit der Graphen-/Cu-Folie oder den Gittern in Kontakt kommen, sauber und staubfrei sind. Deckgläser, die zum Transfer von Graphen verwendet werden, können durch Spülen mit Ethanol und DI-Wasser oder mit einem Staubwedel gereinigt werden. Es wird auch empfohlen, unter einem Abzug zu arbeiten und Graphenplatten und -gitter immer mit Folie oder einer sauberen Glasplatte bedeckt zu halten. Staub oder Verunreinigungen auf den Gittern können verhindern, dass Graphen vollständig an den EM-Gittern haftet. Bei der Handhabung von Graphen oder graphenbeschichteten Gittern ist es wichtig, elektrisch geerdet zu sein, um eine Beschädigung der Graphenfolie durch statische Entladung zu vermeiden. Statische Entladungen können vermieden werden, indem ein Erdungsband am Handgelenk verwendet wird, ein geerdetes Metallobjekt jedes Mal berührt wird, wenn Graphen oder Graphengitter gehandhabt werden, und/oder kein Handschuh an der Hand getragen wird, die die Pinzette24 hält.

Da eine Monolage aus Graphen sehr dünn ist (die Breite eines Kohlenstoffatoms), ist es wichtig, Graphen bei der Übertragung von Graphen auf Gitter mit einer organischen Schicht wie MMA oder Poly-MMA (PMMA) zu unterstützen. PMMA ist das am weitesten verbreitete Material für den Graphentransfer. PMMA hat jedoch eine starke Affinität zu Graphen und kann oft zu Polymerverunreinigungen auf dem Graphenfilm führen. In diesem Protokoll wird MMA verwendet, da es weniger Restkontamination hinterlässt25. Sowohl PMMA als auch MMA haben jedoch den Nachteil, dass sich Falten und Risse bilden, die in einigen Bereichen des Graphenfilms zu beobachten sind (Abbildung 3B). Es kann schwierig sein, diese Falten zu vermeiden, da sie häufig während des Graphenwachstums mit der CVD-Methodeauftreten 31. Kürzlich wurde ein Verfahren entwickelt, um ultraflaches Graphen faltenfrei zu züchten, wobei die Kupferfolie durch einen Cu(111)/Saphir-Wafer als Wachstumssubstrat32 ersetzt wird.

Unserer Erfahrung nach ist es besser, Graphen/Cu-Platten zu kaufen und das Graphen mit MMA im eigenen Haus zu unterstützen, als polymerummantelte Cu-Graphen-Platten von Herstellern zu kaufen, die nach dem Kupferätzen spröde werden und in nachfolgenden Schritten nur schwer zu handhaben sind. Der Spin Coater, den wir für die MMA-Beschichtung verwendet haben, kann kostengünstig mit Teilen aus einem lokalen Computer-/Baumarkt gebaut werden, wie zuvor beschrieben25.

Während des Schritts der MMA-Beschichtung ist es wichtig, die gesamte Graphenoberfläche auf der Cu-Graphen-Folie mit MMA zu bedecken. Nachdem das Cu weggeätzt wurde, wird MMA-Graphen halbtransparent, und Bereiche, die keine MMA-Abdeckung haben, sehen wie leere Löcher aus. Um eine MMA-Beschichtung auf der Kupferseite zu verhindern, ist es wichtig, während der Beschichtung ein kleines Stück Löschpapier darunter zu legen, damit es überschüssiges MMA, das sich aus der CVD-Folie herausdreht, aufsaugt.

Nach dem Ätzen und Spülen kann die MMA/Graphen-Folie mit einem kommerziellen oder selbstgebauten Trogsystem mit einer Spritze oder einer Peristaltikpumpe zur Kontrolle des Wasserstands auf EM-Gitter übertragen werden. Vor dem Transfer ist es wichtig, die Gitter in aufeinanderfolgenden Bädern mit Chloroform, Aceton und IPA gründlich vorzuspülen. Das Einbrennen von graphenbeschichteten Gittern bei 65 °C trägt dazu bei, die Integrität des Graphens zu erhalten und die Adsorption von Graphen an die Gitter zu fördern. Um eine MMA-Kontamination auf den Gittern zu vermeiden, ist es wichtig, MMA gründlich in einem Acetonbad zu entfernen und die Gitter in IPA zu reinigen. Alle ungewaschenen MMA-Rückstände werden auf EM-Gittern beobachtet und verringern das Signal-Rausch-Verhältnis der Bilder (Abbildung 3C). Der Aceton-IPA-Waschvorgang kann wiederholt werden, um die Graphenoberflächen weiter zu reinigen.

Um die Graphengitter hydrophil zu machen, haben wir die Gitter UV/Ozon ausgesetzt. Verschiedene Modelle von UV/Ozon-Reinigern müssen möglicherweise optimiert werden, um die Graphenschicht für die KryoEM-Probenvorbereitung ausreichend mit Sauerstoff anzureichern, ohne das Graphen zu beschädigen. Unabhängig vom System ist es wichtig, diese Gitter unmittelbar nach der UV/Ozon-Behandlung für die Anwendung von KryoEM-Proben zu verwenden. Alternative Methoden, um Graphengitter hydrophil zu machen, werden in anderen Studien beschrieben33,34.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Xiao Fan für die hilfreichen Gespräche bei der Etablierung dieser Methoden bei Scripps Research. B.B. wurde durch ein Postdoktoranden-Forschungsstipendium der Hewitt Foundation for Medical Research unterstützt. W.C. wird durch ein Prädoktorandenstipendium der National Science Foundation unterstützt. D.E.P wird von den National Institutes of Health (NIH) unterstützt, die NS095892 an G.C.L. Dieses Projekt wurde auch durch NIH-Zuschüsse GM142196, GM143805 und S10OD032467 an G.C.L.

Materials

70% EtOH Pharmco (190 pf EtOH) 241000190CSGL
Acetone Sigma Aldrich 650501-4L
Ammonium persulfate (APS) Sigma Aldrich 215589-500g Hazardous; use extreme caution
Chloroform Sigma Aldrich C2432-1L
Clamping TEM Grid Holder Block for 45 Grids PELCO 16830-45
Computer fan Amazon (Noctua) B07CG2PGY6
Cover slip Bellco Glass 1203J71 Standard cover slips
Crystallizing dish Pyrex 3140-100
Electronics duster Falcon Safety Products 75-37-6
Falcon Dust-off Air Duster Staples N/A
Filter papers Whatman 1001-055
Fine tip tweezer Dumont 0508-L4-PO
Flask Pyrex 4980-500
Fork Supermarket N/A
Glass pasteur pipette VWR 14672-608
Graphene/Cu Graphenea N/A CVD monolayer graphene cu
Grid Coating Trough Ladd Research Industries 10840 Fragile
Isopropanol Fisher Scientific 67-63-0
Kapton Tape Amazon (MYJOR) MY-RZY001 Polyimide tape
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Long twzeer Cole Parmer Essentials UX-07387-15
Metal grid holder Ted Pella 16820-81
MMA(8.5)MMA EL 6 KAYAKU Advanced Materials M31006 0500L 1GL Flammable
Model 10 Lab Oven Quincy Lab, Inc. FO19013
Petri dish Pyrex 3610-102
Plasma cleaner (Solarus 950) Gatan, Inc. N/A
Scissors Fiskars 194813-1010
Standard Analog Orbital Shaker VWR 89032-088
UltrAuFoil R1.2/1.3 – Au300 Quantifoil N/A Holey gold grids
Ultraviolet Ozone Cleaning Systems UVOCS model T10X10/OES
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References

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Cryoelectron MicroscopyGrapheneMonolayerSample PreparationAir-water InterfaceHydrophobic EffectDenaturationAggregationComplex DissociationPreferred OrientationBackground NoiseProtein Concentration

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Basanta, B., Chen, W., Pride, D. E., Lander, G. C. Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy. J. Vis. Exp. (199), e65702, doi:10.3791/65702 (2023).
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