التشخيص السريع القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) لعدوى هيليكوباكتر بيلوري ومقاومة المضادات الحيوية
Summary
يقدم البروتوكول طريقة غير جراحية للتشخيص السريع لعدوى المعدة هيليكوباكتر بيلوري من خلال اختبار الأوتار ويحدد مقاومتها للمضادات الحيوية للكلاريثروميسين والليفوفلوكساسين باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR).
Abstract
هيليكوباكتر بيلوري هي أحد مسببات الأمراض البشرية الرئيسية التي تصيب ما يقرب من نصف سكان العالم وأصبحت تهديدا صحيا خطيرا بسبب مقاومتها المتزايدة للمضادات الحيوية. وهو العامل المسبب لالتهاب المعدة النشط المزمن ومرض القرحة الهضمية وسرطان المعدة وقد تم تصنيفه على أنه مادة مسرطنة من المجموعة الأولى من قبل الوكالة الدولية لبحوث السرطان. لذلك ، فإن التشخيص السريع والدقيق لبكتيريا الملوية البوابية وتحديد مقاومتها للمضادات الحيوية مهمان للقضاء الفعال على هذا العامل الممرض البكتيري. حاليا ، تشمل طرق تشخيص H. pylori بشكل أساسي اختبار التنفس اليوريا (UBT) ، واختبار المستضد ، واختبار الأجسام المضادة في الدم ، وتنظير المعدة ، واختبار اليورياز السريع (RUT) ، والثقافة البكتيرية. من بينها ، طرق الكشف الثلاثة الأولى غير جراحية ، مما يعني أنها اختبارات سهلة الإجراء. ومع ذلك ، لا يمكن استرداد البكتيريا من خلال هذه التقنيات. وبالتالي ، لا يمكن إجراء اختبار مقاومة الأدوية. الثلاثة الأخيرة هي فحوصات غازية ، لكنها مكلفة ، وتتطلب مهارات عالية ، ولديها القدرة على التسبب في ضرر للمرضى. لذلك ، فإن الطريقة غير الغازية والسريعة والمتزامنة للكشف عن H. pylori واختبار مقاومة الأدوية مهمة جدا للقضاء على H. pylori بكفاءة في الممارسة السريرية . يهدف هذا البروتوكول إلى تقديم إجراء محدد يتضمن اختبار الأوتار بالاشتراك مع تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) للكشف السريع عن عدوى الملوية البوابية ومقاومة المضادات الحيوية. على عكس المزارع البكتيرية ، تسمح هذه الطريقة بالتشخيص السهل والسريع وغير الباضع لحالة عدوى الملوية البوابية ومقاومة الأدوية. على وجه التحديد ، استخدمنا qPCR للكشف عن rea لعدوى H. pylori والطفرات في جينات 23S rRNA و gyrA ، والتي تشفر المقاومة ضد كلاريثروميسين وليفوفلوكساسين ، على التوالي. بالمقارنة مع تقنيات الاستزراع المستخدمة بشكل روتيني ، يوفر هذا البروتوكول تقنية غير جراحية ومنخفضة التكلفة وموفرة للوقت للكشف عن عدوى الملوية البوابية وتحديد مقاومتها للمضادات الحيوية باستخدام qPCR.
Introduction
H. pylori هي بكتيريا حلزونية الشكل ، شديدة الحركة ، سالبة الجرام تعيش بشكل رئيسي في منطقة البواب في المعدة1. إنه ممرض شائع يصيب ما يقرب من 50٪ من سكان العالم2. معظم الأشخاص المصابين بعدوى الملوية البوابية ليس لديهم مظاهر سريرية ، ومعظمهم يصابون بأمراض مختلفة بعد عدة سنوات من العدوى ، بما في ذلك التهاب المعدة المزمن والقرحة الهضمية وقرحة المعدة وسرطان المعدة3. في العديد من الدراسات القائمة على مجموعات سكانية مختلفة ، تم إثبات فعالية القضاء على H. pylori للوقاية من سرطان المعدة والآفات السابقة للتسرطن 4,5. لذلك ، نصحت الوكالة الدولية لبحوث السرطان التابعة لمنظمة الصحة العالمية (WHO) بالقضاء على بكتيريا الملوية البوابية كإجراء وقائي6.
يعد استخدام الطرق غير الباضعة لتحديد عدوى الملوية البوابية مكونا رئيسيا في علاج معظم الأفراد المصابين بعسر الهضم بدون أعراض. يعد اختبار تنفس اليوريا (UBT) واختبار مستضد البراز H. pylori (SAT) والاختبارات المصلية من التقنيات غير الباضعة الشائعة. من بين هؤلاء ، يعد UBT الإجراء الأقل تدخلا والأكثر دقة المتاح. يستخدم UBT اليوريا ، الموجود بكثرة في H. pylori ، لتحلل اليوريا الموسومة نظائريا إلى الأمونيا وثاني أكسيد الكربون (13C أو 14C). في المقابل ، فإن المقايسة الكروماتوغرافية المناعية (ICA)7 مريحة وبسيطة وغير جراحية لأخذ العينات. ومع ذلك ، تتأثر دقة الاختبار بعدة عوامل ، مثل جودة عينة البراز ودرجة الحرارة والفاصل الزمني بين جمع العينات والاختبار. اختبار آخر يعتمد على الاستجابة المناعية هو اختبار الأجسام المضادة H. pylori في المصل ، والذي يكتشف الأجسام المضادة في مصل المريض. ومع ذلك ، فإن هذا الاختبار غير مناسب لتحليل ما بعد العلاج لأن الأجسام المضادة تبقى لفترة طويلة بعد إزالة البكتيريا8. عيب رئيسي آخر هو أن هذه الطرق تشخص فقط عدوى الملوية البوابية ولا تسمح باختبار مقاومة الأدوية لتوجيه العلاج القائم على الحساسية.
بالنسبة لطرق الاختبار الغازية ، يجب أخذ أنسجة خزعة المعدة عن طريق التنظير الداخلي ثم إخضاعها للأنسجة واختبار اليورياز السريع والثقافة البكتيرية. طرق الاختبار هذه محدودة للغاية أيضا بسبب عدة عوامل. حاليا ، تقتصر هذه التقنيات على المرضى المسنين ، والمرضى المعرضين لخطر كبير للإصابة بمرض سرطاني أو خبيث ، والمرضى الذين فشلوا في علاج الخط الأول لمرض الجزر المعدي المريئي أو عدوى الملوية البوابية 9. ثانيا ، نظرا لخصائص النمو الفريدة ل H. pylori ، فإن معدل نجاح الثقافة البكتيرية يصل فقط إلى 50٪ 10. وبالتالي ، توفر طرق الكشف الجزيئي أملا جديدا للتغلب على المتطلبات العالية لطرق الكشف الغازية وتوجيه العلاج القائم على الحساسية. من بين طرق الكشف الجزيئي ، تطور تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بشكل كبير في السنوات الأخيرة. qPCR ، على عكس PCR التقليدي ، لا يتطلب رحلان كهربائي هلامي ويحدد بدقة الحمض النووي / الحمض النووي الريبي في العينات عن طريق إضافة الاشعال والمجسات في مرحلة التلدين. مجموعات qPCR للكشف عن عدوى الملوية البوابية ومقاومة الأدوية متاحة الآن تجاريا. ومع ذلك ، فإن كل طريقة لها حدودها. لذلك ، ينبغي النظر في التشخيص السريري للمريض وعلاجه بالاقتران مع الأعراض والعلامات والتاريخ والاختبارات المعملية الأخرى والاستجابة للعلاج.
حاليا ، الطريقة الأساسية لعلاج عدوى الملوية البوابية هي تناول المضادات الحيوية ، ولكن في الآونة الأخيرة ، أصبح من الصعب بشكل متزايد علاج هذه الالتهابات بسبب ارتفاع مقاومة المضادات الحيوية. وفي وقت لاحق، لوحظ انخفاض كبير في فعالية علاج بكتيريا الملوية البوابية على الصعيد العالمي، مما يجعل استئصال بكتيريا الملوية البوابية قضية صحية عمومية رئيسية11.
كلاريثروميسين وليفوفلوكساسين هما منشطان واسعا الطيف يستخدمان لعلاج الالتهابات التي تسببها بكتيريا الملوية البوابية، لكن العديد من الدراسات أبلغت عن مقاومة واسعة النطاق ضد هذين العقارين في عزلات الملوية البوابية. A2143G و A2142G و A2142C هي ثلاث من الطفرات النقطية العديدة الموجودة في جين 2.9 kb 23S rRNA والتي تؤدي إلى مقاومة كلاريثروميسين عن طريق منع الماكرولايد من الارتباط. في الوقت نفسه ، توجد مواقع الطفرة في جين مقاومة الليفوفلوكساسين بشكل أساسي في مواقع الطفرات الستة (A260T ، C261A ، T261G ، G271A ، G271T ، A272G) من جين gyrA 12. أدى اكتشاف آليات المقاومة هذه القائمة على الطفرات الجينية إلى تحول تدريجي في الكشف عن بكتيريا الملوية البوابية من خلال الدراسات القائمة على الثقافة إلى الاختبارات الجزيئية.
بشكل عام ، هناك حاجة سريرية ملحة لطريقة تشخيصية غير جراحية وفعالة ومتزامنة للكشف عن عدوى الملوية البوابية ومقاومة الأدوية. اعتمدنا اختبار سلسلة مشترك وطريقة qPCR للتغلب على صعوبات أخذ العينات وتحقيق هدف الكشف المتزامن عن عدوى الملوية البوابية ومقاومة الأدوية باستخدام مجسات أولية مختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن إجراء الكشف عن بكتيريا الملوية البوابية باستخدام كل من الطرق الغازية وغير الغازية13. تتطلب التقنيات الغازية شائعة الاستخدام مثل التشريح المرضي واختبار اليورياز السريع وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والزراعة البكتيرية التنظير الداخلي والخزعة. يوصى بإجراء الاختبا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل مشروع سانمينغ للطب في شنتشن (المنحة رقم. SZSM201510050) ومؤسسة قوانغدونغ للبحوث الأساسية والتطبيقية (منحة رقم 2022A1515220023). مؤسسة أبحاث المواهب المتقدمة في مستشفى مقاطعة غواندونغ الشعبي (No. KJ012021097) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81871734 ، 82072380 ، 82272423). لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.
Materials
| 23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin | |
| ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine | Thermo Fisher Scientific | SEDA 20163220767 | Fluorescent quantitative PCR amplification |
| ABI 7500 software | Thermo Fisher Scientific | Data Analysis | |
| BSC-1500IIA2-X | BIOBASE | SEDA 20143222263 | Biosafety cabinet |
| DNA extraction kit | Daan Gene | ||
| E-Centrifuge | WEALTEC | Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube. | |
| H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing) | Hongmed Infagen | Testing for H. pylori infection | |
| Stream SP96 automated nucleic acid extractor | Daan Gene | SEDA 20140104 | For DNA extraction |
| String test kit | Hongmed Infagen | It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube | |
| Ultra-low temperature freezers (DW-YL450) | MELING | SEDA 20172220091 | -20 °C for storing reagents |
| Vortex-5 | Kylin-bell | For mixing reagent |
References
- Proença-Modena, J. L., Acrani, G. O., Brocchi, M. Helicobacter pylori: Phenotypes, genotypes and virulence genes. Future Microbiology. 4 (2), 223-240 (2009).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Association between alcohol consumption, cigarette smoking, and Helicobacter pylori infection in Iraqi patients submitted to gastrointestinal endoscopy. Journal of Emergency Medicine, Trauma and Acute Care. 2022 (6), 12 (2022).
- Reshetnyak, V. I., Burmistrov, A. I., Maev, I. V. Helicobacter pylori: Commensal, symbiont or pathogen. World Journal of Gastroenterology. 27 (7), 545-560 (2021).
- Thrift, A. P., Wenker, T. N., El-Serag, H. B. Global burden of gastric cancer: Epidemiological trends, risk factors, screening and prevention. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (5), 338-349 (2023).
- Liou, J. M., et al. Screening and eradication of Helicobacter pylori for gastric cancer prevention: The Taipei global consensus. Gut. 69 (12), 2093-2112 (2020).
- IARC Helicobacter pylori Working Group. . Helicobacter Pylori Eradication as A Strategy for Preventing Gastric Cancer. , (2014).
- Vaira, D., et al. The stool antigen test for detection of Helicobacter pylori after eradication therapy. Annals of Internal Medicine. 136 (4), 280-287 (2002).
- Laheij, R. J. F., Straatman, H., Jansen, J. B. M. J., Verbeek, A. L. M. Evaluation of commercially available Helicobacter pylori serology kits: A review. Journal of Clinical Microbiology. 36 (10), 2803-2809 (1998).
- Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection – The Maastricht IV/ Florence consensus report. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
- Peng, X., et al. Gastric juice-based real-time PCR for tailored Helicobacter Pylori treatment: A practical approach. International Journal of Medical Sciences. 14 (6), 595-601 (2017).
- Thung, I., et al. Review article: The global emergence of Helicobacter pylori antibiotic resistance. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (4), 514-533 (2016).
- Zhang, Y., et al. Mutations in the antibiotic target genes related to clarithromycin, metronidazole and levofloxacin resistance in Helicobacter pylori strains from children in China. Infection and Drug Resistance. 13, 311-322 (2020).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of Helicobacter pylori infection by invasive and noninvasive techniques in patients with gastrointestinal diseases from Iraq: A validation study. PLoS One. 16 (8), e0256393 (2021).
- Chen, Q., et al. Advanced sensing strategies based on different types of biomarkers toward early diagnosis of H. pylori. Critical Reviews in Analytical Chemistry. , (2023).
- Hussein, R. A., Al-Ouqaili, M. T. S., Majeed, Y. H. Detection of clarithromycin resistance and 23SrRNA point mutations in clinical isolates of Helicobacter pylori isolates: Phenotypic and molecular methods. Saudi Journal of Biological Sciences. 29 (1), 513-520 (2022).
- Xuan, S. H., Wu, L. P., Zhou, Y. G., Xiao, M. B. Detection of clarithromycin-resistant Helicobacter pylori in clinical specimens by molecular methods: A review. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 4, 35-41 (2016).
- Perez-Trallero, E., Montes, M., Alcorta, M., Zubillaga, P., Telleria, E. Non-endoscopic method to obtain Helicobacter pylori for culture. Lancet. 345 (8950), 622-623 (1995).
- DiNardo, A. R., et al. Use of string test and stool specimens to diagnose pulmonary tuberculosis. International Journal of Infectious Diseases. 41, 50-52 (2015).
- Li, G., et al. Identification of hypervirulent Klebsiella pneumoniae isolates using the string test in combination with Galleria mellonella infectivity. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 39 (9), 1673-1679 (2020).
- Agbonlahor, D. E., Odugbemi, T. O., Udofia, P. O. Differentiation of gram-positive and gram-negative bacteria and yeasts using a modification of the "string" test. The American Journal of Medical Technology. 49 (3), 177-178 (1983).
