Etiketsiz amiloid yapısal karakterizasyonu için polarizasyona duyarlı iki foton mikroskobu
Summary
Bu makale, polarizasyona duyarlı iki foton mikroskobunun etiketsiz amiloid üst yapıları-sferülitler içindeki yerel organizasyonu karakterize etmek için nasıl uygulanabileceğini açıklamaktadır. Ayrıca, numunenin nasıl hazırlanacağını ve ölçüleceğini, gerekli kurulumun nasıl bir araya getirileceğini ve amiloid fibrillerin yerel organizasyonu hakkında bilgi edinmek için verilerin nasıl analiz edileceğini açıklar.
Abstract
Tek fotonlu muadili ile karşılaştırıldığında, iki fotonlu uyarma, daha düşük fototoksisitesi, daha derin doku penetrasyonu, yoğun paketlenmiş sistemlerde verimli çalışması ve floroforların açısal fotoseçiminin azalması nedeniyle biyogörüntüleme deneyleri için faydalıdır. Bu nedenle, iki fotonlu floresan mikroskobunda (2PFM) polarizasyon analizinin tanıtılması, doğrusal optik işlemlere dayalı standart görüntüleme yöntemlerine kıyasla bir numunedeki moleküler organizasyonun daha kesin bir şekilde belirlenmesini sağlar. Bu çalışmada, polarizasyona duyarlı 2PFM (ps-2PFM) ve karmaşık biyo-yapılar-amiloid sferülitler içindeki moleküler sıralamanın belirlenmesindeki uygulamasına odaklanıyoruz. Alzheimer veya Parkinson gibi nörodejeneratif hastalıklar genellikle bozulmuş bir protein yanlış katlanma süreci nedeniyle oluşan amiloidler-protein agregatlarının saptanmasıyla teşhis edilir. Yapılarını keşfetmek, yaratılış yollarının daha iyi anlaşılmasına ve sonuç olarak daha hassas tanı yöntemlerinin geliştirilmesine yol açar. Bu makale, sığır insülin sferülitleri ve küresel amiloidojenik protein agregatları içindeki lokal fibril sıralamasının belirlenmesi için uyarlanmış ps-2PFM’yi sunmaktadır. Ayrıca, önerilen tekniğin sferülit içindeki fibrillerin üç boyutlu organizasyonunu çözebileceğini kanıtlıyoruz.
Introduction
Geçtiğimiz on yıllar boyunca, proteinlerin ve agregalarınınbiyogörüntülemesi için çok sayıda floresan mikroskobu tekniğinde önemli bir gelişme olmasına rağmen1, numune 2,3 içindeki yerel sıralamalarını çözmek için sadece birkaçı kullanılmıştır. Amiloid üst yapıları-sferülitlerin içsel yapısal heterojenliğini incelemek için floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu4 kullanıldı. Ayrıca, küresellikler gibi karmaşık ve yoğun paketlenmiş biyoyapılar içindeki yerel düzenin nicel olarak belirlenmesi, polarizasyona duyarlı yöntemler kullanılarak çözülebilir3. Bununla birlikte, floroforları in vivo olarak uyarmak için UV-VIS dalga boylarının kullanılması yüksek doku ışığı saçılımına yol açtığından, yüzeysel doku penetrasyonuna sahip standart floresan teknikleri sınırlıdır5. Ek olarak, bu tür görüntüleme genellikle spesifik floresan probların tasarlanmasını ve hedeflenen bir biyomoleküle bağlanmasını gerektirir, böylece görüntüleme yapmak için gereken iş maliyetini ve miktarını arttırır.
Son zamanlarda, bu sorunları ele almak için ekibimiz, biyolojik yapılarınetiketsiz görüntülenmesi için polarizasyona duyarlı iki foton uyarımlı floresan mikroskobunu (ps-2PFM) uyarladı 6,7. Ps-2PFM, iki fotonlu floresan yoğunluğunun, uyarma ışınının doğrusal polarizasyon yönüne bağımlılığının ölçülmesine ve yayılan floresan8’in polarizasyonunun analizine izin verir. Bu tekniğin uygulanması, ışık polarizasyon düzlemini kontrol etmek için standart çoklu foton mikroskobu kurulum uyarma yolunun (Şekil 1) bir yarım dalga plakası ile desteklenmesini gerektirir. Daha sonra, iki foton uyarılmış floresan yoğunluğunun uyarma lazer ışınının polarizasyonuna bağımlılığını gösteren kutupsal grafikler, iki çığ fotodiyotu tarafından toplanan sinyallerden oluşturulur, böylece floresan polarizasyonunun karşılıklı olarak dik iki bileşeni toplanır.
Son adım, dikroik aynalar veya yüksek sayısal açıklık objektifi gibi optik elemanların polarizasyon üzerindeki etkisini dikkate alan veri analizi sürecidir. İki foton işleminin doğası gereği, bu yöntem hem azaltılmış açısal foto seçimi hem de gelişmiş eksenel çözünürlük sağlar, çünkü odak düzlemi dışındaki floroforların iki foton uyarımı olasılıksal olarak sınırlıdır. Derin doku görüntüleme için yakın kızılötesi probların (NIR) in vivo görüntülenmesi için benzer yöntemlerin başarıyla uygulanabileceği de kanıtlanmıştır9. Ps-2PFM daha önce hücre zarları10 ve DNA 11,12’deki floroforların yanı sıra altın nanopartiküller13 gibi biyolojik sistemlerin standart olmayan floresan belirteçlerini görüntülemek için uygulanmıştır. Bununla birlikte, tüm bu örneklerde, biyomoleküllerin organizasyonu hakkındaki bilgiler dolaylı olarak elde edildi ve bir florofor ile bir biyomolekül arasında önceden tanımlanmış bir karşılıklı oryantasyon gerektirdi.
Son makalelerimizden birinde, ps-2PFM’nin, amiloid üst yapılarının otofloresansının lokal polarizasyonunu ve küreülitlerdeki amiloid fibrillere bağlı amiloid spesifik bir boya olan Thioflavin T’den floresansın belirlenmesi için başarıyla uygulanabileceğini gösterdik6. Ayrıca, bir diğerinde, ps-2PFM’nin mikron altı boyut rejiminde amiloid sferülitler içindeki amiloid fibril oryantasyonunu tespit etmek için kullanılabileceğini kanıtladık ve bu, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görüntüleme ile ilişkilendirilerek doğrulandı7. Bu sonucun elde edilmesi, i) bir veya iki fotonla uyarıldığında küresel-amiloidlerin içsel otofloresansı, 450 ila 500 nm aralığında bulunan emisyon maksimumları ile içsel otofloresan ve standart floresan boyalarla karşılaştırılabilir iki foton absorpsiyon kesiti14, ii) biyolojik membranları ve DNA yapılarını etiketleyen boyaların ps-2PEF’inin nasıl uygulanabileceğini açıklamak için daha önce tanıtılan matematiksel modeller sayesinde mümkün olmuştur. Küreselitler ve bunlara bağlı boyalar tarafından sergilenen floresan 8,11,15. Bu nedenle, analize geçmeden önce, bu konuyla ilgili ilk makalemizin hem ana metninde hem de destekleyici bilgilerinde açıklanan gerekli teoriye bakmanızı şiddetle tavsiye ederiz6. Burada, sığır insülin sferülitlerinin etiketsiz amiloid yapısal karakterizasyonu için ps-2PFM tekniğinin nasıl uygulanacağına ilişkin protokolü sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polarizasyona duyarlı iki foton mikroskobu, standart çoklu foton kurulumunda sadece küçük değişiklikler gerektiren, amiloid üst yapıları içindeki fibrillerin yerel sırasını incelemek için değerli bir araçtır. Doğrusal olmayan optik fenomenler üzerinde çalıştığından, tek foton uyarımlı floresan mikroskobu yöntemlerine kıyasla azaltılmış açısal foto seçimi ve gelişmiş eksenel çözünürlük elde edilebilir. Ek olarak, tek foton uyarma floresan mikroskobu tekniklerine kıyasla daha dü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Polonya Ulusal Bilim Merkezi tarafından finanse edilen Sonata Bis 9 projesi (2019/34/E/ST5/00276) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Sample preparation | |||
| Coverslips, 24 x 24 mm | Chemland | 04-298.202.04 | |
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich | 6522 | Slide mountant |
| Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene | Chemland | 02-63102 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | Used for spherulite incubation | |
| HLP 5UV Water purification system | Hydrolab | Source of dionized water used in sample preparation | |
| Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10), | Sigma-Aldrich | 30721-M | |
| Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC)) | Sigma-Aldrich | I5500 | |
| Methanol (HPLC grade) | Sigma-Aldrich | 270474 | |
| Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm | Chemland | 04-296.202.09 | |
| Olympus BX60 | Olympus | Polarized Optical Microscope used in Figure 2 | |
| PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2 | Chemland | VIT131097 | |
| Microscope ps-2PFM setup | |||
| Chameleon Ultra II | Coherent | ||
| FELH0800 – Ø25.0 mm Longpass Filter | Thorlabs | ||
| FESH0700 – Ø25.0 mm Shortpass Filter | Thorlabs | ||
| IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes | ID Quantique | ||
| Multiphoton short-pass emission filter 720 nm | Semrock | ||
| Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm | Thorlabs | ||
| Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA | Nikon | ||
| piezo 3D stage | Piezosystem Jena | ||
| Polarizing Beamsplitter | Thorlabs | ||
| S130C – Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 – 1100 nm, 500 mW | Thorlabs | ||
| Software | |||
| LabView 2018 | National Instruments | Version 18.0.1f2 | |
| Matplotlib library | Version 3.3.2 | ||
| NumPy library | Version 1.19.2 | ||
| SciPy library | Version 1.5.2 | ||
| Spyder Python 3 IDE | Version 4.1.5 |
References
- Petazzi, R. A., Aji, A. K., Chiantia, S., Giraldo, J., Ciruela, F. . Progress in Molecular Biology and Translational Science. 169, 1-41 (2020).
- Kress, A., et al. Probing orientational behavior of MHC class I protein and lipid probes in cell membranes by fluorescence polarization-resolved imaging. Biophysical Journal. 101 (2), 468-476 (2011).
- Duboisset, J., et al. Thioflavine-T and Congo Red reveal the polymorphism of insulin amyloid fibrils when probed by polarization-resolved fluorescence microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (3), 784-788 (2013).
- De Luca, G., et al. Probing ensemble polymorphism and single aggregate structural heterogeneity in insulin amyloid self-assembly. Journal of Colloid and Interface Science. 574, 229-240 (2020).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Obstarczyk, P., Lipok, M., Grelich-Mucha, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. Two-photon excited polarization-dependent autofluorescence of amyloids as a label-free method of fibril organization imaging. The Journal of Physical Chemistry Letters. 12 (5), 1432-1437 (2021).
- Obstarczyk, P., Lipok, M., Żak, A., Cwynar, P., Olesiak-Bańska, J. Amyloid fibrils in superstructures – local ordering revealed by polarization analysis of two-photon excited autofluorescence. Biomaterials Science. 10 (6), 1554-1561 (2022).
- Le Floc’h, V., Brasselet, S., Roch, J. -. F., Zyss, J. Monitoring of orientation in molecular ensembles by polarization sensitive nonlinear microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (45), 12403-12410 (2003).
- Chen, C., et al. In vivo near-infrared two-photon imaging of amyloid plaques in deep brain of Alzheimer’s disease mouse model. ACS Chemical Neuroscience. 9 (12), 3128-3136 (2018).
- Gasecka, P., Balla, N. K., Sison, M., Brasselet, S. Lipids-fluorophores interactions probed by combined nonlinear polarized microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (50), 13718-13729 (2021).
- Mojzisova, H., et al. Polarization-sensitive two-photon microscopy study of the organization of liquid-crystalline DNA. Biophysical Journal. 97 (8), 2348-2357 (2009).
- Olesiak-Banska, J., et al. Liquid crystal phases of DNA: Evaluation of DNA organization by two-photon fluorescence microscopy and polarization analysis. Biopolymers. 95 (6), 365-375 (2011).
- Olesiak-Banska, J., et al. Gold nanorods as multifunctional probes in a liquid crystalline DNA matrix. Nanoscale. 5 (22), 10975-10981 (2013).
- Grelich-Mucha, M., Lipok, M., Różycka, M., Samoć, M., Olesiak-Bańska, J. One- and two-photon excited autofluorescence of lysozyme amyloids. The Journal of Physical Chemistry Letters. 13 (21), 4673-4681 (2022).
- Brasselet, S., Mély, Y., Duportail, G., et al. . Fluorescent Methods to Study Biological Membranes. , 311-337 (2013).
- Krebs, M. R., et al. The formation of spherulites by amyloid fibrils of bovine insulin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (40), 14420-14424 (2004).
- Aït-Belkacem, D., Gasecka, A., Munhoz, F., Brustlein, S., Brasselet, S. Influence of birefringence on polarization resolved nonlinear microscopy and collagen SHG structural imaging. Optics Express. 18 (14), 14859-14870 (2010).
- Schön, P., Munhoz, F., Gasecka, A., Brustlein, S., Brasselet, S. Polarization distortion effects in polarimetric two-photon microscopy. Optics Express. 16 (25), 20891-20901 (2008).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50 (6), 823-839 (2006).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Ferrand, P., et al. Ultimate use of two-photon fluorescence microscopy to map orientational behavior of fluorophores. Biophysical Journal. 106 (11), 2330-2339 (2014).
- Chipman, R. A. Depolarization index and the average degree of polarization. Applied Optics. 44 (13), 2490-2495 (2005).
- de Reguardati, S., Pahapill, J., Mikhailov, A., Stepanenko, Y., Rebane, A. High-accuracy reference standards for two-photon absorption in the 680–1050 nm wavelength range. Optics Express. 24 (8), 9053-9066 (2016).
- Mansfield, J. C., Mandalia, V., Toms, A., Winlove, C. P., Brasselet, S. Collagen reorganization in cartilage under strain probed by polarization sensitive second harmonic generation microscopy. Journal of The Royal Society Interface. 16 (150), 20180611 (2019).
- Duboisset, J., Aït-Belkacem, D., Roche, M., Rigneault, H., Brasselet, S. Generic model of the molecular orientational distribution probed by polarization-resolved second-harmonic generation. Physical Review A. 85 (4), 043829 (2012).
- Loksztejn, A., Dzwolak, W. Chiral Bifurcation in aggregating insulin: an induced circular dichroism study. Journal of Molecular Biology. 379 (1), 9-16 (2008).
