Поляризационно-чувствительная двухфотонная микроскопия для определения структуры амилоида без меток

За последние десятилетия, несмотря на значительное развитие многочисленных методов флуоресцентной микроскопии для биовизуализации белков и их агрегатов¹, лишь немногие из них были использованы для разрешения их локального упорядочения в образце ^2,3. Методом флуоресцентной пожизненной визуализационной микроскопии⁴ изучена внутренняя структурная гетерогенность амилоидных суперструктур-сферолитов. Кроме того, количественное определение локального упорядочения внутри сложных и плотно упакованных биоструктур, таких как сферолиты, может быть решено с помощью поляризационно-чувствительных методов³. Однако стандартные методы флуоресценции с проникновением в поверхностные ткани ограничены, поскольку использование длин волн УФ-ВИД для возбуждения флуорофоров in vivo приводит к высокому^{рассеянию света} в тканях. Кроме того, такая визуализация часто требует разработки и привязки специфических флуоресцентных зондов к целевой биомолекуле, тем самым увеличивая стоимость и объем работы, необходимой для выполнения визуализации.

Недавно, для решения этих проблем, наша команда адаптировала поляризационно-чувствительную двухфотонную возбужденную флуоресцентную микроскопию (ps-2PFM) для безметочной визуализации биологических структур ^6,7. Ps-2PFM позволяет измерять зависимость интенсивности двухфотонной флуоресценции от направления линейной поляризации пучка возбуждения и анализировать поляризацию излучаемой флуоресценции⁸. Реализация данной методики требует дополнения стандартного тракта возбуждения многофотонной установки микроскопа (рис. 1) полуволновой пластиной для управления плоскостью поляризации света. Затем из сигналов, собранных двумя лавинными фотодами, создаются полярные графики, изображающие зависимость интенсивности двухфотонной возбужденной флуоресценции от поляризации возбуждающего лазерного пучка, собирая таким образом две, взаимно перпендикулярные составляющие поляризации флуоресценции.

Последним этапом является процесс анализа данных с учетом влияния оптических элементов, таких как дихроичные зеркала или объектив с высокой числовой апертурой, на поляризацию. Из-за природы двухфотонного процесса этот метод обеспечивает как уменьшенный угловой фотоотбор, так и повышенное осевое разрешение, так как двухфотонное возбуждение флуорофоров вне фокальной плоскости вероятностно ограничено. Также было доказано, что аналогичные методы могут быть успешно реализованы для визуализации in vivo зондов ближнего инфракрасного диапазона (NIR) для визуализации глубоких тканей⁹. Ранее Ps-2PFM применялся для изображения флуорофоров в клеточных мембранах¹⁰ и ДНК^11,12, а также в качестве нестандартных флуоресцентных маркеров биологических систем, таких как наночастицы золота¹³. Однако во всех этих примерах информация об организации биомолекул была получена опосредованно и требовала заранее определенной взаимной ориентации между флуорофором и биомолекулой.

В одной из наших недавних работ мы показали, что ps-2PFM может быть успешно применен для определения локальной поляризации автофлуоресценции амилоидных суперструктур и флуоресценции тиофлавина Т, амилоид-специфического красителя, связанного с амилоидными фибриллами в сферулитах⁶. Кроме того, в другом исследовании мы доказали, что ps-2PFM может быть использован для определения ориентации амилоидных фибрилл внутри амилоидных сферолитов в субмикронном режиме, что было подтверждено путем корреляции с изображениями просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)⁷. Достижение этого результата стало возможным благодаря i) собственной автофлуоресценции сферолитов-амилоидов при возбуждении одним или двумя фотонами проявлять собственную автофлуоресценцию с максимумами излучения, расположенными в диапазоне от 450 до 500 нм, и сечениями поглощения двух фотонов, сопоставимыми со стандартными флуоресцентными красителями¹⁴, ii) математическими моделями, введенными ранее для описания того, как ps-2PEF красителей, мечущих биологические мембраны и структуры ДНК, могут быть применены для Флуоресценция проявляется сферолитами и связанными с ними красителями ^8,11,15. Таким образом, прежде чем приступить к анализу, мы настоятельно рекомендуем ознакомиться с необходимой теорией, описанной как в основном тексте, так и в вспомогательной информации нашей первой статьи по^{этой теме6}. Здесь мы представляем протокол применения метода ps-2PFM для структурной характеристики амилоида бычьих инсулиновых сферолитов без меток.