Microscopia de dois fótons sensível à polarização para caracterização estrutural amiloide livre de marcação

Nas últimas décadas, embora tenha havido um desenvolvimento significativo de inúmeras técnicas de microscopia de fluorescência para bioimagem de proteínas e seus^agregados1, poucas têm sido utilizadas para resolver sua ordenação local dentro da amostra ^2,3. A microscopia de imagem de tempo de vida de fluorescência⁴ foi usada para estudar a heterogeneidade estrutural intrínseca de superestruturas-esferulitos amiloides. Além disso, a determinação quantitativa da ordenação local dentro de bioestruturas complexas e densamente compactadas, como esferulitos, poderia ser resolvida usando métodos sensíveis à polarização³. No entanto, as técnicas padrão de fluorescência com penetração de tecido superficial são limitadas, uma vez que o uso de comprimentos de onda UV-VIS para excitar fluoróforos in vivo leva a um alto espalhamento de luz tecidual⁵. Além disso, essas imagens geralmente requerem o projeto e a ligação de sondas fluorescentes específicas a uma biomolécula alvo, aumentando assim o custo e a quantidade de trabalho necessário para realizar imagens.

Recentemente, para abordar essas questões, nossa equipe adaptou microscopia de fluorescência excitada de dois fótons sensível à polarização (ps-2PFM) para imagens livres de marcação de estruturas biológicas ^6,7. A MAPP Ps-2 permite medir a dependência da intensidade de fluorescência de dois fótons na direção de polarização linear do feixe de excitação e analisar a polarização da fluorescência emitida⁸. A implementação desta técnica requer a complementação do caminho de excitação padrão do microscópio multifóton (Figura 1) com uma placa de meia-onda para controlar o plano de polarização da luz. Em seguida, gráficos polares, retratando a dependência da intensidade de fluorescência excitada de dois fótons na polarização do feixe de laser de excitação, são criados a partir de sinais coletados por dois fotodiodos de avalanche, coletando assim os dois componentes mutuamente perpendiculares da polarização de fluorescência.

A última etapa é o processo de análise dos dados, levando em conta o impacto dos elementos ópticos, como espelhos dicroicos ou uma objetiva de alta abertura numérica, na polarização. Devido à natureza do processo de dois fótons, este método fornece tanto uma foto-seleção angular reduzida quanto uma resolução axial aprimorada, já que a excitação de dois fótons de fluoróforos fora do plano focal é probabilisticamente limitada. Também foi comprovado que métodos semelhantes poderiam ser implementados com sucesso para imagens in vivo de sondas de infravermelho próximo (NIR) para imagens de tecidos profundos⁹. A Ps-2PFM foi previamente aplicada em fluoróforos de imagem em membranas celulares¹⁰ e DNA^11,12, bem como marcadores fluorescentes não padronizados de sistemas biológicos, como nanopartículas de ouro¹³. No entanto, em todos esses exemplos, as informações sobre a organização de biomoléculas foram obtidas indiretamente e exigiram uma orientação mútua pré-definida entre um fluoróforo e uma biomolécula.

Em um de nossos trabalhos recentes, mostramos que a ps-2PFM pode ser aplicada com sucesso para determinar a polarização local da autofluorescência de superestruturas amiloides e fluorescência a partir de tioflavina T, um corante amilóide-específico, ligado a fibrilas amiloides em esferulitos⁶. Além disso, em outro, comprovamos que a ps-2PFM poderia ser utilizada para detectar a orientação da fibrila amiloide dentro de esferulitos amiloides em um regime de tamanho sub-mícron, o que foi confirmado pela correlação com imagens de microscopia eletrônica de transmissão (MET)⁷. A obtenção deste resultado foi possível graças a i) autofluorescência intrínseca de esferulitos-amiloides, quando excitadas com um ou dois fótons, exibem autofluorescência intrínseca com máximos de emissão localizados em uma faixa de 450 a 500 nm e seções transversais de absorção de dois fótons comparáveis com corantes fluorescentes padrão¹⁴, ii) modelos matemáticos introduzidos anteriormente para descrever como ps-2PEF de corantes marcando membranas biológicas e estruturas de DNA poderiam ser aplicados a fluorescência exibida por esferulitos e corantes a eles ligados ^8,11,15. Assim, antes de prosseguir com a análise, é altamente recomendável examinar a teoria necessária descrita no texto principal e nas informações de apoio de nosso primeiro artigo sobre este tópico⁶. Apresentamos aqui o protocolo de aplicação da técnica de ps-2PFM para a caracterização estrutural amiloide livre de rótulos de esferulitos de insulina bovina.