偏光感受性2光子顕微鏡によるラベルフリーアミロイド構造解析

過去数十年にわたり、タンパク質とその凝集体のバイオイメージングのための多数の蛍光顕微鏡技術が大幅に開発されてきましたが^{1、サンプル内の}局所的な秩序を解明するために使用されたのはごくわずかです^2,3。蛍光寿命イメージング顕微鏡⁴は、アミロイド上部構造-球晶石の本質的な構造不均一性を研究するために使用されました。さらに、球晶石のような複雑で高密度に充填された生体構造内の局所秩序の定量的決定は、分極に敏感な方法を使用して解決することができました³。しかし、UV-VIS波長を使用してin vivoで蛍光色素を励起すると、組織の光散乱が大きくなるため、表在組織浸透を伴う標準的な蛍光技術には限界^{があります5。}さらに、このようなイメージングでは、特定の蛍光プローブを設計し、標的とする生体分子に結合する必要があることが多く、イメージングを行うために必要なコストと作業量が増加します。

最近、これらの問題に対処するために、私たちのチームは、偏光感受性二光子励起蛍光顕微鏡(ps-2PFM)を適応させ、生体構造のラベルフリーイメージングに用いることにした^6,7。Ps-2PFMは、励起ビームの直線偏光方向に対する2光子蛍光強度の依存性の測定と、放出された蛍光の偏光の分析を可能にする⁸。この技術を実装するには、標準的な多光子顕微鏡セットアップ励起経路(図1)に、光の偏光面を制御するための半波長板を追加する必要があります。次に、2つのアバランシェフォトダイオードによって収集された信号から、励起レーザービームの偏光に対する2光子励起蛍光強度の依存性を示す極性グラフが作成され、蛍光偏光の2つの相互に垂直な成分が収集されます。

最後のステップは、ダイクロイックミラーや高開口対物レンズなどの光学素子が偏光に与える影響を考慮したデータ解析プロセスです。2光子プロセスの性質上、焦点面外の蛍光色素の2光子励起は確率的に制限されるため、この方法では角度光選択の低減と軸方向分解能の向上の両方が得られます。また、深部組織イメージング用の近赤外プローブ(NIR)のin vivoイメージングにも同様の手法をうまく実装できることが証明されました⁹。Ps-2PFMは、細胞膜^{10やDNA11,12}の蛍光色素や、金ナノ粒子¹³などの生体系の非標準蛍光マーカーのイメージングに応用されている。しかし、これらすべての例において、生体分子の組織に関する情報は間接的に得られたものであり、蛍光色素と生体分子の間にあらかじめ定義された相互配向を必要とした。

最近の論文では、ps-2PFMを応用して、アミロイド上部構造の自家蛍光と、球状突起中のアミロイド線維に結合したアミロイド特異的色素であるチオフラビンTの蛍光の局所偏光を解析できることを示しました⁶。さらに、別の研究では、ps-2PFMを利用して、アミロイドスフェルライト内のアミロイド線維配向をサブミクロンサイズで検出できることを証明し、透過型電子顕微鏡(TEM)イメージングとの相関関係で確認しました⁷。この成果の達成は、i)1つまたは2つの光子で励起されたときに、球晶アミロイドの固有の自家蛍光が、450〜500nmの範囲にある発光最大値と標準的な蛍光色素に匹敵する2光子吸収断面積を示す¹⁴、ii)生体膜およびDNA構造を標識する色素のps-2PEFをどのように適用できるかを説明するために以前に紹介した数理モデルのおかげで可能になりました球状物質^{とそれらに}結合した染料によって示される蛍光^8,11,15。したがって、分析を進める前に、このトピック⁶に関する最初の論文の本文と補足情報の両方に説明されている必要な理論に目を通すことを強くお勧めします。ここでは、ウシインスリン球状突起のラベルフリーアミロイド構造解析にps-2PFM法を適用する方法のプロトコルを紹介します。