Microscopie à deux photons sensible à la polarisation pour une caractérisation de la structure amyloïde sans marquage

Au cours des dernières décennies, bien qu’il y ait eu un développement significatif de nombreuses techniques de microscopie à fluorescence pour la bio-imagerie des protéines et de leurs agrégats¹, seules quelques-unes ont été utilisées pour résoudre leur ordre local au sein de l’échantillon ^2,3. La microscopie d’imagerie à durée de vie de fluorescence⁴ a été utilisée pour étudier l’hétérogénéité structurale intrinsèque des superstructures-sphérolites amyloïdes. De plus, la détermination quantitative de l’ordre local à l’intérieur de biostructures complexes et densément emballées telles que les sphérulites pourrait être résolue à l’aide de méthodes sensibles à la polarisation³. Cependant, les techniques de fluorescence standard avec pénétration superficielle des tissus sont limitées car l’utilisation de longueurs d’onde UV-VIS pour exciter les fluorophores in vivo conduit à une diffusion élevée de la lumière tissulaire⁵. De plus, une telle imagerie nécessite souvent de concevoir et de lier des sondes fluorescentes spécifiques à une biomolécule ciblée, ce qui augmente le coût et la quantité de travail nécessaire pour effectuer l’imagerie.

Récemment, pour résoudre ces problèmes, notre équipe a adapté la microscopie à fluorescence excitée à deux photons sensible à la polarisation (ps-2PFM) pour l’imagerie sans marquage des structures biologiques ^6,7. Ps-2PFM permet de mesurer la dépendance de l’intensité de la fluorescence à deux photons sur la direction de polarisation linéaire du faisceau d’excitation et d’analyser la polarisation de la fluorescence émise⁸. La mise en œuvre de cette technique nécessite de compléter le chemin d’excitation standard du microscope multiphotonique (Figure 1) par une plaque demi-onde pour contrôler le plan de polarisation de la lumière. Ensuite, des graphiques polaires, illustrant la dépendance de l’intensité de fluorescence excitée à deux photons sur la polarisation du faisceau laser d’excitation, sont créés à partir de signaux collectés par deux photodiodes à avalanche, rassemblant ainsi les deux composantes mutuellement perpendiculaires de la polarisation de fluorescence.

La dernière étape est le processus d’analyse des données, en tenant compte de l’impact des éléments optiques, tels que les miroirs dichroïques ou un objectif à grande ouverture numérique, sur la polarisation. En raison de la nature du processus à deux photons, cette méthode permet à la fois une photo-sélection angulaire réduite et une résolution axiale améliorée, car l’excitation à deux photons des fluorophores en dehors du plan focal est limitée de manière probabiliste. Il a également été prouvé que des méthodes similaires pouvaient être mises en œuvre avec succès pour l’imagerie in vivo de sondes dans le proche infrarouge (NIR) pour l’imagerie des tissus profonds⁹. Le Ps-2PFM a déjà été appliqué à l’imagerie des fluorophores dans les membranes cellulaires¹⁰ et l’ADN^11,12, ainsi qu’à des marqueurs fluorescents non standard de systèmes biologiques, tels que les nanoparticules d’or¹³. Cependant, dans tous ces exemples, l’information sur l’organisation des biomolécules a été obtenue indirectement et a nécessité une orientation mutuelle prédéfinie entre un fluorophore et une biomolécule.

Dans l’un de nos articles récents, nous avons montré que le ps-2PFM pouvait être appliqué avec succès pour déterminer la polarisation locale de l’autofluorescence des superstructures amyloïdes et de la fluorescence de la thioflavine T, un colorant spécifique de l’amyloïde, lié aux fibrilles amyloïdes dans les sphérulites⁶. De plus, dans un autre cas, nous avons prouvé que le ps-2PFM pouvait être utilisé pour détecter l’orientation des fibrilles amyloïdes à l’intérieur des sphérulites amyloïdes dans un régime de taille submicronique, ce qui a été confirmé en le corrélant avec l’imagerie par microscopie électronique à transmission (MET)⁷. L’obtention de ce résultat a été possible grâce à i) l’autofluorescence intrinsèque des sphéroulites-amyloïdes, lorsqu’elles sont excitées avec un ou deux photons, présente une autofluorescence intrinsèque avec des maxima d’émission situés dans une gamme de 450 à 500 nm et des sections efficaces d’absorption à deux photons comparables à celles des colorants fluorescents standard¹⁴, ii) des modèles mathématiques introduits précédemment pour décrire comment le ps-2PEF des colorants marquant les membranes biologiques et les structures de l’ADN pourrait être appliqué à fluorescence manifestée par les sphérulites et les colorants qui leur sont liés ^8,11,15. Ainsi, avant de procéder à l’analyse, nous vous recommandons vivement de consulter la théorie requise décrite à la fois dans le texte principal et les informations à l’appui de notre premier article sur ce sujet⁶. Nous présentons ici le protocole d’application de la technique ps-2PFM pour une caractérisation structurale amyloïde sans marquage des sphérulites d’insuline bovine.